【摘 要】
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目的 对常规实时荧光定量PCR(RT-PCR)的标准曲线法进行改进,以建立一种更为准确的RT-PCR的标准曲线定量法.方法 通过构建β-actin、KLK11的质粒DNA标准品,以β-actin质粒DNA
【机 构】
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中山大学生命科学学院,广州市第一人民医院泌尿外科
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目的 对常规实时荧光定量PCR(RT-PCR)的标准曲线法进行改进,以建立一种更为准确的RT-PCR的标准曲线定量法.方法 通过构建β-actin、KLK11的质粒DNA标准品,以β-actin质粒DNA为正常对照,制作内参基因和目的 基因的标准曲线,获得各自的扩增曲线.RT-PCR检测两种基因在恶性前列腺组织细胞LNCAP中的表达,并将改进的标准曲线法与常规的标准曲线法分别对β-actin/KLK11实时定量PCR的结果进行分析,分析两种方法的差异,以衡量新方法的准确性.结果 所得β-actin和KLK11的标准曲线线性相关性良好(β-actin R2=0.991,KLK11R2=0.992),但两种基因的扩增效率有差异(β-actin 123%,KLK11 99%).两种不同的标准曲线法处理后得到不同的结果:常用标准曲线法结果显示KLK11在LNCAP中有表达下调,而改进的标准曲线法得出KLK11在LNCAP中上调4.46倍.目的 基因与内参基因的扩增效率差异有统计学意义(t=4.829,P＜0.05).结论 与常规的绝对定量法比较,改进的标准曲线法避免了因默认目的 基因与内参基因有相同的扩增效率而导致的错误,是一种更为准确的荧光定量PCR分析方法.
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