【摘 要】
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牛支原体(Mycoplasma bovis,M.b)是牛(Bos taurus)的一种重要致病性支原体,感染后可引起牛多种疾病。丙酮酸脱氢酶复合体E1(pyruvate dehydrogenase E1,PDHc E1)是参与生物体
【基金项目】
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甘肃省自然科学基金项目(No.1308RJZA235);甘肃省高等学校基本科研业务费项目
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牛支原体(Mycoplasma bovis,M.b)是牛(Bos taurus)的一种重要致病性支原体,感染后可引起牛多种疾病。丙酮酸脱氢酶复合体E1(pyruvate dehydrogenase E1,PDHc E1)是参与生物体糖代谢过程的一个限速酶,广泛存在于微生物、哺乳动物及高等植物中,其直接影响丙酮酸向乙酰辅酶A的转化。本研究参照Gen Bank中M.b PG45株的PDHc E1α亚基基因pdhα和PDHc E1β亚基基因pdhβ序列设计引物,通过PCR扩增获得M.b武威株的pdhα(Gen Bank登录号:KU355295)及pdhβ基因(Gen Bank登录号:KU355296),在序列测定的基础上应用重叠延伸PCR(Overlap PCR)技术完成基因优化并构建原核表达质粒p ET-pdhα和p ET-pdhβ。表达质粒分别转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)后经异丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达重组PDHc E1α亚基融合蛋白PDHA及PDHc E1β亚基蛋白PDHB。纯化表达产物并分别免疫新西兰兔(Oryctolagus cuniculus)制备多克隆抗体,进而应用Western blot及酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)对M.b PDHc E1α亚基和PDHc E1β亚基在细胞内的分布进行了初步研究。结果表明,经IPTG的诱导,pdhα与pdhβ基因在大肠杆菌BL21(DE3)中均成功表达,重组蛋白r PDHA及r PDHB的分子量分别约为40和37 k D,且均有良好的免疫原性,而Western blot及ELISA结果证实E1α和E1β在牛支原体细胞膜上和胞浆中均有分布且分布量相当。本研究结果为进一步研究M.b生物学功能提供了基础资料。
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