论文部分内容阅读
目的 探讨阳离子聚合物即线性聚乙烯亚胺(PEI)介导下兔角膜基质注射PEGFP-IL-1ra质粒进行基因角膜原位转染的有效性和安全性.方法 以人cDNA文库为模板进行聚合酶链反应(PCR),获得人IL-1ra cDNA片段,构建重组质粒PEGFP-hIL-1ra.以阳离子聚合物为介导转染角膜内皮细胞,通过绿色荧光蛋白(GFP)示踪、蛋白免疫印迹技术检测转染后IL-1ra基因和蛋白的表达.实验组30只Wistar大鼠角膜基质注射PEGFP-hIL-1 ra质粒和PEI-in-vivo的混合溶液20μl(含10μg质粒),对照组15只Wistar大鼠角膜基质注射PEI-in-vivo溶液20μl.注射后1、3、6、14、21 d,收集角膜通过HE染色、透射电镜、锥虫蓝-茜素红染色、免疫组织化学观察IL-1ra基因角膜原位转染后的细胞结构和功能的变化.荧光显微镜下追踪IL-1ra-GFP融合蛋白在角膜的表达部位和表达强度.结果 以cDNA文库为模板扩增出hIL-1 ra cDNA片段,构建重组质粒PEGFP-hIL-1ra.经PstI和BamHI酶切及DNA测序证实了插入片段方向和大小正确.PEI-in-vitro介导下PEGFP-hIL-1ra转染角膜内皮细胞12 h后,可见10%～15%细胞中有GFP荧光表达.Western-blotting检测可见相对分子质量为44 000的hIL-1ra-GFP蛋白表达.PEGFP-hIL-1ra质粒和PEI-in-vivo角膜基质注射后1 d,角膜上皮基底细胞可见荧光条带,6 d时全角膜荧光强度达到高峰,14 d开始减弱,21 d角膜上皮层尚存微弱荧光.对照组观察期内始终未见绿色荧光.实验组角膜HE染色未见病理性改变,角膜上皮基底细胞层p63抗体阳性;锥虫蓝-茜素红联合染色未见角膜内皮细胞损伤;透射电镜显示角膜各层细胞的细胞质内可见IL-1ra-GFP颗粒,未见细胞器的损害.结论 阳离子聚合物介导下角膜基质注射PEGFP-hIL-1ra质粒可快速、有效地将IL-1ra基因转入角膜并表达,为临床上使用抗炎细胞因子IL-1ra对角膜免疫炎性反应相关疾病进行基因治疗提供了新的技术平台.