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摘要：本试验以总黄酮的提取率为评价指标，通过正交试验法筛选乌腺金丝桃总黄酮超声提取最佳工艺。结果表明：超声提取总黄酮的影响因素顺序为乙醇浓度>温度>超声功率>提取时间>料液比，最佳工艺条件是用样品22倍量的体积分数为60%乙醇，采用超声功率120W在超声温度60℃条件下提取50分钟，在此条件下总黄酮提取率是8.15%。
关键词：乌腺金丝桃;总黄酮;超声提取;正交设计
基金项目：吉林农业科技学院大学生创新项目（2015008）
中图分类号： S567 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2016.24.043
乌腺金丝桃是藤黄科草本植物，功效为镇痛、止血、通乳，主要应用于吐血、子宫出血、风湿关节痛、神经痛、跌打损伤、乳腺炎[1]。研究表明，其具有治疗心脏病、抗肿瘤等作用，主要药效物质为黄酮类化合物[2，3]。黄酮类化合物因其具有抗菌、抗炎、免疫调节、抗肿瘤、镇痛、保肝、利尿、调节血管渗透性、延缓衰老、防护紫外线损伤等广谱的药理作用引人瞩目[4]。鉴于乌腺金丝桃总黄酮提取工艺的研究少见报道[5]，且用超声法从乌腺金丝桃中提取总黄酮的研究未见文献报道，笔者在本试验中采用正交试验设计，对影响其提取率的多个因素进行了考察，以期优选出超声法提取乌腺金丝总黄酮的最佳工艺。
1 材料
1.1 试剂与材料
本试验材料为乌腺金丝桃叶，于2015年9月采自吉林农业科技学院左家校区乌腺金丝桃试验田，鼓风烘干（50℃）备用。金丝桃苷标准品;无水乙醇、甲醇、亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠。
1.2 仪器
电热鼓风干燥箱、 电子分析天平、循环水式真空泵、旋转蒸发仪、超声波清洗器、紫外可见分光光度计。
2方法
2.1试验流程
样品称重超声提取抽滤滤液浓缩定容离心测定含量计算提取率。
2.2标准品溶液的配制
精密稱取金丝桃苷标准品3.8毫克，溶解于甲醇中，制成浓度为380微克/毫升的标准品母液。
2.3 空白溶液的配制
取甲醇0.5毫升，加入5% NaNO2溶液0.3毫升，摇匀，放置6分钟，加入10% Al（NO3）3溶液0.3毫升，摇匀，放置6分钟，再加入4% NaOH溶液3毫升，摇匀，放置15分钟，即为空白对照液[3]。
2.4测定波长的选择
对2份样品和金丝桃苷对照品经显色后，在350～700nm范围内扫描。金丝桃苷对照品的λmax=530nm处，样品提取液的λmax=525～527nm，故选择显色后在527nm处测定吸光度。
2.5标准曲线的绘制
取母液稀释得系列浓度标准品溶液。分别取各浓度标准品溶液0.5毫升，按2.3项操作，离心，在527nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，金丝桃苷浓度为横坐标做标准曲线，得线性方程y=0.0006x+0.00765（R2=0.99905），线性范围是5.93～380微克 /毫升。
2.6样品溶液的制备和总黄酮提取率的计算
取药材粗粉2.0克，精密称取，用乙醇溶液超声提取。提取液抽滤浓缩，用甲醇定容并依据试验情况适当稀释，精密量取溶液0.5毫升，按按2.5项操作，测定吸光度（A），计算总黄酮的含量及总黄酮的提取率，提取率=样品中总黄酮的量/药材重量×100%。
2.7单因素考察
平行条件分别考察乙醇浓度、温度、提取时间、料液比、超声功率在不同水平下对乌腺金丝桃中总黄酮提取效果的影响。
2.8正交试验
采用L9（34）正交试验安排表进行试验，以考察多因素对提取过程的交互影响，从而筛选出超声提取最佳工艺。因素及水平设置见表1。
3 结果与分析
表1超声提取法的L9（34）正交因素水平表
表2单因素考察结果
3.1单因素考察结果
单因素考察结果见表2，结果表明，乙醇浓度、温度、提取时间、超声功率对总黄酮提取效果有影响，料液比对提取效果影响不大，确定提取时料液比为1∶22。依据结果确定正交试验各因素的合理水平。
3.2 正交试验结果
表3 超声法提取的正交试验结果
极差分析结果的R值大小表明，四种因素对乌腺金丝桃中总黄酮提取影响程度A>B>D>C，即乙醇浓度>温度>超声功率>提取时间，说明因素A为影响乌腺金丝桃中总黄酮提取率的主要因素;四种因素的K值表明各因素水平的影响程度是A1>A2>A3，B2>B3>B1，C3> C1>C2，D2>D3>D1，综上所述，理论最佳的工艺条件是A1B2C3D2，即样品用60%乙醇采用超声功率为120W在超声温度60℃条件下提取50分钟，见表3。
3.3 验证性试验结果
按照上述确定的最佳条件，取5份样品做了5次平行试验，总黄酮平均提取率8.15%，算得相对标准偏差RSD=2.77%<3%，进一步说明正交试验所得的最佳条件为提取乌腺金丝桃总黄酮较为理想的工艺。
4 结语
以总黄酮提取率为评价指标的正交试验结果表明，乙醇浓度对乌腺金丝桃中总黄酮的提取影响程度显著，提取温度与超声功率影响次之、提取时间与料液比影响程度较小;正交试验分析及验证性试验结果表明，乌腺金丝桃中总黄酮超声提取最佳工艺条件是样品用22倍量的体积分数为60%乙醇采用超声功率为120W在超声温度60℃条件下提取50分钟，在此条件下总黄酮提取率是8.15%。
参考文献
[1]周繇.中国长白山植物资源志[M].北京：中国林业出版社，2010：304.
[2]马育轩，王艳丽，周海纯，等.乌腺金丝桃的化学成分及药理作用研究进展[J].中医药学报，2012，40（06）：125-126.
[3]高彦宇.乌腺金丝桃对缺血性心脏病模型动物的药效物质基础及作用机理的研究[D].黑龙江中医药大学，2008.
[4]曹纬国，刘志勤，邵云，等.黄酮类化合物药理作用的研究进展[J].西北植物学报，2003，23（12）：2241-2247.
[5]王秀丽，宋志坚，王小东，等.正交试验优化稳心草总黄酮提取工艺[J].科技创新导报，2012，（22）：192，194.
作者简介：薛颖，吉林农业科技学院，在读本科生，研究方向：中药学。
通讯作者：肖凤艳，硕士，吉林农业科技学院/长白山动植物资源利用与保护吉林省高校重点实验室，副教授，研究方向：中药资源开发。
关键词：乌腺金丝桃;总黄酮;超声提取;正交设计
基金项目：吉林农业科技学院大学生创新项目（2015008）
中图分类号： S567 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2016.24.043
乌腺金丝桃是藤黄科草本植物，功效为镇痛、止血、通乳，主要应用于吐血、子宫出血、风湿关节痛、神经痛、跌打损伤、乳腺炎[1]。研究表明，其具有治疗心脏病、抗肿瘤等作用，主要药效物质为黄酮类化合物[2，3]。黄酮类化合物因其具有抗菌、抗炎、免疫调节、抗肿瘤、镇痛、保肝、利尿、调节血管渗透性、延缓衰老、防护紫外线损伤等广谱的药理作用引人瞩目[4]。鉴于乌腺金丝桃总黄酮提取工艺的研究少见报道[5]，且用超声法从乌腺金丝桃中提取总黄酮的研究未见文献报道，笔者在本试验中采用正交试验设计，对影响其提取率的多个因素进行了考察，以期优选出超声法提取乌腺金丝总黄酮的最佳工艺。
1 材料
1.1 试剂与材料
本试验材料为乌腺金丝桃叶，于2015年9月采自吉林农业科技学院左家校区乌腺金丝桃试验田，鼓风烘干（50℃）备用。金丝桃苷标准品;无水乙醇、甲醇、亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠。
1.2 仪器
电热鼓风干燥箱、 电子分析天平、循环水式真空泵、旋转蒸发仪、超声波清洗器、紫外可见分光光度计。
2方法
2.1试验流程
样品称重超声提取抽滤滤液浓缩定容离心测定含量计算提取率。
2.2标准品溶液的配制
精密稱取金丝桃苷标准品3.8毫克，溶解于甲醇中，制成浓度为380微克/毫升的标准品母液。
2.3 空白溶液的配制
取甲醇0.5毫升，加入5% NaNO2溶液0.3毫升，摇匀，放置6分钟，加入10% Al（NO3）3溶液0.3毫升，摇匀，放置6分钟，再加入4% NaOH溶液3毫升，摇匀，放置15分钟，即为空白对照液[3]。
2.4测定波长的选择
对2份样品和金丝桃苷对照品经显色后，在350～700nm范围内扫描。金丝桃苷对照品的λmax=530nm处，样品提取液的λmax=525～527nm，故选择显色后在527nm处测定吸光度。
2.5标准曲线的绘制
取母液稀释得系列浓度标准品溶液。分别取各浓度标准品溶液0.5毫升，按2.3项操作，离心，在527nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，金丝桃苷浓度为横坐标做标准曲线，得线性方程y=0.0006x+0.00765（R2=0.99905），线性范围是5.93～380微克 /毫升。
2.6样品溶液的制备和总黄酮提取率的计算
取药材粗粉2.0克，精密称取，用乙醇溶液超声提取。提取液抽滤浓缩，用甲醇定容并依据试验情况适当稀释，精密量取溶液0.5毫升，按按2.5项操作，测定吸光度（A），计算总黄酮的含量及总黄酮的提取率，提取率=样品中总黄酮的量/药材重量×100%。
2.7单因素考察
平行条件分别考察乙醇浓度、温度、提取时间、料液比、超声功率在不同水平下对乌腺金丝桃中总黄酮提取效果的影响。
2.8正交试验
采用L9（34）正交试验安排表进行试验，以考察多因素对提取过程的交互影响，从而筛选出超声提取最佳工艺。因素及水平设置见表1。
3 结果与分析
表1超声提取法的L9（34）正交因素水平表
表2单因素考察结果
3.1单因素考察结果
单因素考察结果见表2，结果表明，乙醇浓度、温度、提取时间、超声功率对总黄酮提取效果有影响，料液比对提取效果影响不大，确定提取时料液比为1∶22。依据结果确定正交试验各因素的合理水平。
3.2 正交试验结果
表3 超声法提取的正交试验结果
极差分析结果的R值大小表明，四种因素对乌腺金丝桃中总黄酮提取影响程度A>B>D>C，即乙醇浓度>温度>超声功率>提取时间，说明因素A为影响乌腺金丝桃中总黄酮提取率的主要因素;四种因素的K值表明各因素水平的影响程度是A1>A2>A3，B2>B3>B1，C3> C1>C2，D2>D3>D1，综上所述，理论最佳的工艺条件是A1B2C3D2，即样品用60%乙醇采用超声功率为120W在超声温度60℃条件下提取50分钟，见表3。
3.3 验证性试验结果
按照上述确定的最佳条件，取5份样品做了5次平行试验，总黄酮平均提取率8.15%，算得相对标准偏差RSD=2.77%<3%，进一步说明正交试验所得的最佳条件为提取乌腺金丝桃总黄酮较为理想的工艺。
4 结语
以总黄酮提取率为评价指标的正交试验结果表明，乙醇浓度对乌腺金丝桃中总黄酮的提取影响程度显著，提取温度与超声功率影响次之、提取时间与料液比影响程度较小;正交试验分析及验证性试验结果表明，乌腺金丝桃中总黄酮超声提取最佳工艺条件是样品用22倍量的体积分数为60%乙醇采用超声功率为120W在超声温度60℃条件下提取50分钟，在此条件下总黄酮提取率是8.15%。
参考文献
[1]周繇.中国长白山植物资源志[M].北京：中国林业出版社，2010：304.
[2]马育轩，王艳丽，周海纯，等.乌腺金丝桃的化学成分及药理作用研究进展[J].中医药学报，2012，40（06）：125-126.
[3]高彦宇.乌腺金丝桃对缺血性心脏病模型动物的药效物质基础及作用机理的研究[D].黑龙江中医药大学，2008.
[4]曹纬国，刘志勤，邵云，等.黄酮类化合物药理作用的研究进展[J].西北植物学报，2003，23（12）：2241-2247.
[5]王秀丽，宋志坚，王小东，等.正交试验优化稳心草总黄酮提取工艺[J].科技创新导报，2012，（22）：192，194.
作者简介：薛颖，吉林农业科技学院，在读本科生，研究方向：中药学。
通讯作者：肖凤艳，硕士，吉林农业科技学院/长白山动植物资源利用与保护吉林省高校重点实验室，副教授，研究方向：中药资源开发。