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摘要：从草鱼肠道中分离获得1株细菌，编号为CAX1，进行细菌形态学观察、理化特征、16S rDNA序列分析及药敏试验等研究。结果表明CAX1菌株为革兰氏阴性短杆菌，进一步采用PCR方法扩增其16S rDNA，测序显示其大小为 1 531 bp，序列比对表明CAX1分离株与厦门不动杆菌新种（Acinetobacter xiamenensis）16S rDNA同源性达97.1%，系统进化树分析显示CAX1菌株与不动杆菌亲缘关系最近，自然聚类为1支；药敏试验结果显示CAX1菌株对庆大霉素、阿莫西林、氨苄西林、头孢哌酮等药物敏感。
关键词：草鱼；肠道细菌；分离鉴定；药敏试验；系统进化树
中图分类号： S943.112.42 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2016）11-0256-02
不动杆菌属（Acinetobacter）菌株在自然界广泛存在，主要分布在水体和土壤中，易在潮湿环境中生存，目前确定的不动杆菌属至少有10多个种[1-3]，包括鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumanii）、鲁菲不动杆菌（Acinetobacter lwoffi）、溶血不动杆菌（Acinetobacter haemolytius）、琼氏不动杆菌（Acinetobacter junii）、约翰逊不动杆菌（Acinetobacter johnsonii）、醋酸鈣不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus），以及新发现的厦门不动杆菌（Acinetobacter xiamenensis）、不动杆菌（Acinetobacter guillouiae）等。近年来，一般认为不动杆菌多为条件致病菌，其中鲍曼不动杆菌引起医院内感染频发，耐药菌株不断增多，因此该属细菌被广泛关注[4]。最近，国内学者从异育银鲫、锦鲤等鱼类体内分离到致病性鲍曼不动杆菌、琼氏不动杆菌等[5-6]。但是，目前尚未见鱼源厦门不动杆菌分离鉴定相关研究。本研究以草鱼为研究对象，从其肠道中分离获得1株不动杆菌，并进行细菌形态学、生理生化以及16S rDNA测序等分析鉴定为厦门不动杆菌，这为草鱼不动杆菌的分离鉴定以及肠道微生态研究积累了科学资料。
1 材料与方法
1.1 材料
草鱼购自徐州市某市场。LB培养基、细菌生化微量鉴定和药敏试纸均购自杭州微生物制剂有限公司。细菌基因组DNA提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒、pMD18-T、Master Mix均购自TaKaRa公司。
1.2 方法
1.2.1 细菌分离、鉴定、理化性质及药敏试验 参照沈晓静等的方法[7]进行细菌分离纯化、革兰氏染色及生化鉴定，将纯化培养后的细菌分别接种于21种生化管中，28 ℃培养 24～28 h，观察分离细菌的生理生化反应。无菌环境下将药敏纸片分别置于涂有均匀菌液的LB固体培养基表面，28 ℃培养16～18 h后测量抑菌圈直径，计算平均值，确定该菌对不同药物的敏感程度。
1.2.2 细菌总DNA提取、16S rDNA基因PCR扩增 采用细菌基因组提取试剂盒提取细菌总DNA，PCR扩增反应体系（25 μL）：DNA模板1 μL，细菌通用引物（27F：AGAGTTTGATCATGGCTCA，1492R：TACGGTTACCTTGTTACGACTT）各1 μL，Master Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反应条件：94 ℃ 预变性2 min；94 ℃变性40 s，53 ℃复性40 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。琼胶糖凝胶电泳进一步检测PCR结果，PCR产物切胶回收，连接pMD18-T载体，转化后筛选阳性克隆，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。
1.2.3 系统发育树分析 将16S rDNA序列通过NCBI的Blast检索系统进行序列同源性分析，使用 ClustalX 1.81 软件进行多序列比对，采用MEGA 4.1软件邻接法（neighbor joining）构建系统发育树。
2 结果与分析
2.1 细菌分离
从市售草鱼肠道内分离纯化获得1株细菌，编号为CAX1，革兰氏染色观察为阴性小杆菌，多为单个分散分布。CAX1菌株接种于LB培养基28 ℃培养24 h后，为光滑、透明、表面湿润、边缘整齐的圆形菌落（图1）。
2.2 理化特征及药敏试验结果
对分离菌进行生化特性检测，结果（表1）表明，CAX1菌株为葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖检测试验呈阳性，精氨酸双水解、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、葡萄糖酸盐、肌醇、麦芽糖、甘露醇、乳糖、蜜二糖、鼠李糖、硫化氢、山梨醇、木糖醇、木糖检测试验呈阴性。药敏试验结果显示CAX1菌株对庆大霉素、阿莫西林、头孢哌酮、复方新诺明等9种抗生素敏感，对诺氟沙星、头孢孟多、头孢噻吩、先锋霉素Ⅳ、氯霉素、四环素等抗生素不敏感。
2.3 16S rDNA基因测序及系统发育树分析
以CAX1细菌基因组DNA为模板，采用PCR方法扩增CAX1菌株的16S rDNA序列，电泳检测发现约在 1 500 bp 处有明显目的条带；进一步对16S rDNA测序表明目的片段大小为1 531 bp。将16S rDNA通过Blast检索系统进行序列比对分析，结果表明CAX1菌株与厦门不动杆菌新种序列同源性为97.1%。系统进化树分析结果显示CAX1菌株与不动杆菌的亲缘关系最近，自然聚类为1支（图2）。
3 讨论
不动杆菌属是一类非发酵革兰氏阴性杆菌，在水体和土壤中分布广泛。研究表明不动杆菌是一种条件致病菌，一般认为毒力较低，在机体抵抗力下降或免疫功能受损时易出现机会感染[6-8]。鲍曼不动杆菌是医院感染的重要病原菌之一。刘子骥等认为洛菲不动杆菌与呼吸道感染有关[3]。明德松等研究报道鲁氏不动杆菌对β-内酰胺类药物普遍耐药，对氨基糖苷类、氟喹诺酮类、磺胺类、四环素类等敏感[2]。黄林等研究发现不动杆菌能引起肉质腐败，主要利用氨基酸，致腐能力较低[9]。在鱼类中，目前对不动杆菌研究报道主要有鲍曼不动杆菌、琼氏不动杆菌和洛菲不动杆菌[10-11]。陈翠珍等从锦鲤体内分离出琼氏不动杆菌[5]。毛芝娟等分离获得琼氏不动杆菌，引起患病史氏鲟症状为体表褪色、肛门红肿、腹腔肿大伴有大量血性腹水[10]。陆文浩等从异育银鲫分离鉴定出鲍曼不动杆菌，患病症状为腹腔积水、咽腔组织充血和鳃组织发炎等[6]。张涵等研究表明三角帆蚌、银鲫、青鱼、鳙等肠道优势菌群均有不动杆菌属，推测不动杆菌为淡水鱼类肠道优势菌[11]。目前尚无研究表明厦门不动杆菌对鱼类具有致病性[12]。本研究从草鱼肠道分离获得CAX1菌株，采用细菌形态学观察、理化特征、16S rDNA序列以及系统发育树分析等方法，最终鉴定为厦门不动杆菌，在鱼类肠道中尚属首次报道，有待于进一步深入研究。药敏试验结果表明，CAX1菌株对庆大霉素、阿莫西林、氨苄西林、头孢哌酮、复方新诺明等抗生素敏感，以上研究为鱼类不动杆菌的分离鉴定以及肠道微生态研究提供科学参考。
参考文献：
[1]胡 源，何丽华，张建中. 鲍曼不动杆菌临床分离株分子生物学鉴定分析[J]. 疾病监测，2010，25（3）：202-204.
[2]明德松，潘艳萍，朱 炎. 鲁氏不动杆菌的临床分布及耐药性分析[J]. 中华医院感染学杂志，2014，24（10）：2351-2353.
[3]刘子骥，王 焱，岳启安，等. 新型洛菲不动杆菌的分离与鉴定[J]. 中国病原生物学杂志，2011，6（7）：494-496.
[4]韩 蕾，张旭燕，韩少山，等. 临床致病性不动杆菌的分子生物学鉴定[J]. 西安交通大学学报：医学版，2012，33（5）：611-616.
[5]陈翠珍，张晓君，房 海，等. 锦鲤中琼氏不动杆菌的分离与鉴定[J]. 水生态学杂志，2009，2（1）：86-90.
[6]陆文浩，陈 辉，王习达，等. 异育银鲫致病性鲍曼不动杆菌的鉴定和系统发育分析[J]. 中国兽医科学，2009，39（4）：303-309.
[7]沈晓静，胡秀彩，兰 云，等 .锦鲤荧光假单胞菌的分离鉴定及药敏试验[J]. 水产科学，2014，33（7）：443-446.
[8]李劲松，魏殿军，祁 伟，等. 鲍曼不动杆菌临床分离株的耐药分析[J]. 天津医药，2003，31（6）：373-375.
[9]黄 林，陈全胜，张燕华，等. 冷却猪肉优势腐败菌分离鉴定及致腐能力测定[J]. 食品科学，2013，34（1）：205-209.
[10]毛芝娟，毛甬州，汪建萍. 两株鱼源琼氏不动杆菌的分离、鉴定和耐药特性分析[J]. 水产学报，2013，37（10）：1572-1576.
[11]张 涵，周 涛，王 岩. 综合养殖池塘中三角帆蚌和鱼类肠道细菌的组成[J]. 水生生物学报，2013，37（5）：824-835.
[12]刘 君，宋晓玲，陈志鑫. 益生菌对水产动物的作用研究进展[J]. 动物医学进展，2009，30（9）：78-81.
关键词：草鱼；肠道细菌；分离鉴定；药敏试验；系统进化树
中图分类号： S943.112.42 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2016）11-0256-02
不动杆菌属（Acinetobacter）菌株在自然界广泛存在，主要分布在水体和土壤中，易在潮湿环境中生存，目前确定的不动杆菌属至少有10多个种[1-3]，包括鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumanii）、鲁菲不动杆菌（Acinetobacter lwoffi）、溶血不动杆菌（Acinetobacter haemolytius）、琼氏不动杆菌（Acinetobacter junii）、约翰逊不动杆菌（Acinetobacter johnsonii）、醋酸鈣不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus），以及新发现的厦门不动杆菌（Acinetobacter xiamenensis）、不动杆菌（Acinetobacter guillouiae）等。近年来，一般认为不动杆菌多为条件致病菌，其中鲍曼不动杆菌引起医院内感染频发，耐药菌株不断增多，因此该属细菌被广泛关注[4]。最近，国内学者从异育银鲫、锦鲤等鱼类体内分离到致病性鲍曼不动杆菌、琼氏不动杆菌等[5-6]。但是，目前尚未见鱼源厦门不动杆菌分离鉴定相关研究。本研究以草鱼为研究对象，从其肠道中分离获得1株不动杆菌，并进行细菌形态学、生理生化以及16S rDNA测序等分析鉴定为厦门不动杆菌，这为草鱼不动杆菌的分离鉴定以及肠道微生态研究积累了科学资料。
1 材料与方法
1.1 材料
草鱼购自徐州市某市场。LB培养基、细菌生化微量鉴定和药敏试纸均购自杭州微生物制剂有限公司。细菌基因组DNA提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒、pMD18-T、Master Mix均购自TaKaRa公司。
1.2 方法
1.2.1 细菌分离、鉴定、理化性质及药敏试验 参照沈晓静等的方法[7]进行细菌分离纯化、革兰氏染色及生化鉴定，将纯化培养后的细菌分别接种于21种生化管中，28 ℃培养 24～28 h，观察分离细菌的生理生化反应。无菌环境下将药敏纸片分别置于涂有均匀菌液的LB固体培养基表面，28 ℃培养16～18 h后测量抑菌圈直径，计算平均值，确定该菌对不同药物的敏感程度。
1.2.2 细菌总DNA提取、16S rDNA基因PCR扩增 采用细菌基因组提取试剂盒提取细菌总DNA，PCR扩增反应体系（25 μL）：DNA模板1 μL，细菌通用引物（27F：AGAGTTTGATCATGGCTCA，1492R：TACGGTTACCTTGTTACGACTT）各1 μL，Master Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反应条件：94 ℃ 预变性2 min；94 ℃变性40 s，53 ℃复性40 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。琼胶糖凝胶电泳进一步检测PCR结果，PCR产物切胶回收，连接pMD18-T载体，转化后筛选阳性克隆，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。
1.2.3 系统发育树分析 将16S rDNA序列通过NCBI的Blast检索系统进行序列同源性分析，使用 ClustalX 1.81 软件进行多序列比对，采用MEGA 4.1软件邻接法（neighbor joining）构建系统发育树。
2 结果与分析
2.1 细菌分离
从市售草鱼肠道内分离纯化获得1株细菌，编号为CAX1，革兰氏染色观察为阴性小杆菌，多为单个分散分布。CAX1菌株接种于LB培养基28 ℃培养24 h后，为光滑、透明、表面湿润、边缘整齐的圆形菌落（图1）。
2.2 理化特征及药敏试验结果
对分离菌进行生化特性检测，结果（表1）表明，CAX1菌株为葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖检测试验呈阳性，精氨酸双水解、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、葡萄糖酸盐、肌醇、麦芽糖、甘露醇、乳糖、蜜二糖、鼠李糖、硫化氢、山梨醇、木糖醇、木糖检测试验呈阴性。药敏试验结果显示CAX1菌株对庆大霉素、阿莫西林、头孢哌酮、复方新诺明等9种抗生素敏感，对诺氟沙星、头孢孟多、头孢噻吩、先锋霉素Ⅳ、氯霉素、四环素等抗生素不敏感。
2.3 16S rDNA基因测序及系统发育树分析
以CAX1细菌基因组DNA为模板，采用PCR方法扩增CAX1菌株的16S rDNA序列，电泳检测发现约在 1 500 bp 处有明显目的条带；进一步对16S rDNA测序表明目的片段大小为1 531 bp。将16S rDNA通过Blast检索系统进行序列比对分析，结果表明CAX1菌株与厦门不动杆菌新种序列同源性为97.1%。系统进化树分析结果显示CAX1菌株与不动杆菌的亲缘关系最近，自然聚类为1支（图2）。
3 讨论
不动杆菌属是一类非发酵革兰氏阴性杆菌，在水体和土壤中分布广泛。研究表明不动杆菌是一种条件致病菌，一般认为毒力较低，在机体抵抗力下降或免疫功能受损时易出现机会感染[6-8]。鲍曼不动杆菌是医院感染的重要病原菌之一。刘子骥等认为洛菲不动杆菌与呼吸道感染有关[3]。明德松等研究报道鲁氏不动杆菌对β-内酰胺类药物普遍耐药，对氨基糖苷类、氟喹诺酮类、磺胺类、四环素类等敏感[2]。黄林等研究发现不动杆菌能引起肉质腐败，主要利用氨基酸，致腐能力较低[9]。在鱼类中，目前对不动杆菌研究报道主要有鲍曼不动杆菌、琼氏不动杆菌和洛菲不动杆菌[10-11]。陈翠珍等从锦鲤体内分离出琼氏不动杆菌[5]。毛芝娟等分离获得琼氏不动杆菌，引起患病史氏鲟症状为体表褪色、肛门红肿、腹腔肿大伴有大量血性腹水[10]。陆文浩等从异育银鲫分离鉴定出鲍曼不动杆菌，患病症状为腹腔积水、咽腔组织充血和鳃组织发炎等[6]。张涵等研究表明三角帆蚌、银鲫、青鱼、鳙等肠道优势菌群均有不动杆菌属，推测不动杆菌为淡水鱼类肠道优势菌[11]。目前尚无研究表明厦门不动杆菌对鱼类具有致病性[12]。本研究从草鱼肠道分离获得CAX1菌株，采用细菌形态学观察、理化特征、16S rDNA序列以及系统发育树分析等方法，最终鉴定为厦门不动杆菌，在鱼类肠道中尚属首次报道，有待于进一步深入研究。药敏试验结果表明，CAX1菌株对庆大霉素、阿莫西林、氨苄西林、头孢哌酮、复方新诺明等抗生素敏感，以上研究为鱼类不动杆菌的分离鉴定以及肠道微生态研究提供科学参考。
参考文献：
[1]胡 源，何丽华，张建中. 鲍曼不动杆菌临床分离株分子生物学鉴定分析[J]. 疾病监测，2010，25（3）：202-204.
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[6]陆文浩，陈 辉，王习达，等. 异育银鲫致病性鲍曼不动杆菌的鉴定和系统发育分析[J]. 中国兽医科学，2009，39（4）：303-309.
[7]沈晓静，胡秀彩，兰 云，等 .锦鲤荧光假单胞菌的分离鉴定及药敏试验[J]. 水产科学，2014，33（7）：443-446.
[8]李劲松，魏殿军，祁 伟，等. 鲍曼不动杆菌临床分离株的耐药分析[J]. 天津医药，2003，31（6）：373-375.
[9]黄 林，陈全胜，张燕华，等. 冷却猪肉优势腐败菌分离鉴定及致腐能力测定[J]. 食品科学，2013，34（1）：205-209.
[10]毛芝娟，毛甬州，汪建萍. 两株鱼源琼氏不动杆菌的分离、鉴定和耐药特性分析[J]. 水产学报，2013，37（10）：1572-1576.
[11]张 涵，周 涛，王 岩. 综合养殖池塘中三角帆蚌和鱼类肠道细菌的组成[J]. 水生生物学报，2013，37（5）：824-835.
[12]刘 君，宋晓玲，陈志鑫. 益生菌对水产动物的作用研究进展[J]. 动物医学进展，2009，30（9）：78-81.