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【摘 要】 目的探析基于双向位点特异性PCR的金银花真伪鉴别方法。方法将88份金银花真品、金银花伪品及两者混杂品随机分为两组，每组44份。对照组采用实验鉴别，观察组采用双向位点特异性PCR技术辨别，对比分析鉴别效果。结果当退火温度为61℃时，真品金银花条带为468hp，伪品条带为324hp，正品金银花中掺杂5%以上伪品可同时出现正品与伪品条带，两组在鉴别结果有明显差异（P>0.05）；观察组的鉴别时间短于对照组（P<0.05）。结论双向位点特异性PCR检测技术可有效辨别金银花的真品、伪品及混杂品，在未破坏金银花样本组织结构及材质的情况下，可有效辨别金银花真伪，具有较强的优良性。
【关键词】 双向位点特异性PCR 金银花 真伪鉴别
金银花又名忍冬，药科金银花属忍冬科忍冬属植物及同属植物干燥花蕾或带初开的花，外貌上形似于华南忍冬，具有清热解毒之功效。伪品金银花[1-2]主要包括苦糖果、金银木，且无正品金银花的药效，如被误当真品服用，将会延误治疗。因此，采用正确的方法对其真伪进行辨别尤为重要。本文选取来自11个产地的88份植物样本为研究对象，对双向位点特异性PCR鉴别金银花真伪的重要价值进行评价，具体如下。
1 材料与方法
1.1 材料
选取来自山东平邑、河南封丘、河北巨鹿、广西马山、湖南隆回及湖北、江西、广东、重庆、陕西、江西11个产地的88份植物样本为研究对象，所选样本主要包括忍冬32个，华南忍冬6个，灰毡毛忍冬8个，黄褐毛忍冬8个，水忍冬12个，金银忍冬6个，繁果忍冬7个，红腺忍冬9个。所有药材均经相关部门批准，符合药材选择标准[1]。同时，选取购自市场上经炮制的药材进行双向位点特异性PCR鉴别。
1.2 仪器与试剂
1.2.1 仪器
选用东胜龙二代ETC811新款PCR仪为检测仪器，温度为0-105℃，热盖温度30-110℃，显示精度为0.1℃，温度准确度性为±0.1℃@55℃，温度均一性为<0.3℃@55℃，温度梯度为5℃/s，梯度跨度为1-42℃，输入电压为AC220V（±10%）50/60Hz。选用Eppendorf小型台式冷冻高速离心机5427R，温度范围为-11℃～40℃，离心计时为10s-10h，最大功率为550W，最大容量为48×1.5/2.0ml。选用Biorad伯乐凝胶成像系统，检测器为CCD，像素为4.65×4.65μm，像素密度为4096，工作湿度为<70%，工作温度为10-28℃。
1.2.2 试剂
SunShineBio琼脂糖（原产于西班牙，供应商：南京生兴生物技术有限公司）；Sigma-Aldric溴化乙啶（原产于美国，供应商：北京基尼亚生物技术有限公司）；Promega聚合酶（保定市凌业商贸有限公司）。
1.3 方法
观察组：取干燥材料100mg，并提取入选材料的DNA，不同样品的DNA浓度约为10mg/L，利用引物（trnF、trnL，各0.2pmol）对PCR反应及DNA质量进行检测。在PCR扩增仪上进行反应，待反应结束后在反应体系中增加适量缓冲剂，待混合均匀后在EB染色的1%琼脂酸凝胶点上检测，并使用凝胶成像系统进行系统化的观察。
对照组：取该品粉末0.2g，加入5ml甲醇，并将其放置12小时后过滤溶液，使用照高效液相色谱法对金银花含量进行检测。
1.4 统计学方法
本研究所有数据均采用SPSS13.0统计软件进行数据统计，计量资料用（x+s）进行表示，计数资料用%表示，P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 SNP位点的筛选与引物
根据数据库中显示的忍冬属植物的叶绿体序列，并使用软件对比不同序列间的内在联系，对忍冬属植物的trnF-trnL序列进行分析，结果显示trnF-trnL序列的625位均为G，而其他物种均为A。以SNP为主要位点，双向位点特异性PCR引物的序列情况如表1所示。
2.2 双向位点特异性PCR反应条件
在建立单侧位点特异性PCR的基础上设计另一侧的引物，并优化反应循环数目及内侧与外侧的引物浓度，确定Bi-PASA的反应条件。实验研究结果表明，对APRMS分型产生影响的相关因素较多，其中包括退火温度、Tap酶种类、用量等，且金银花的使用量相对较低。但由于Bi-PASA所使用巢式引物极易造成正常的PCR扩增过程受限，因此，将Bi-PASA内外侧的比例优化为3：1，此时，金银花Bi-PASA的结果最佳。
2.3 金银花真伪
当退火温度为61℃时，真品金银花条带为468hp，伪品条带为324hp，正品金银花中掺杂5%以上伪品可同时出现正品与伪品条带。
2.4 两种鉴别方法的鉴别时间比较
观察组的鉴别所用时间为（3.56±1.25）h，对照组的鉴别所用时间为（11.25±2.96）h，观察组明显优于对照组，两组组件有显著差异（P<0.05）。
3 讨论
本次研究结果显示，两组在鉴别结果上午明显差异（P>0.05）；观察组的鉴别时间短于对照组（P<0.05）。本结果与相关研究结果相符[3]。
综上所述，双向位点特异性PCR检测技术可有效辨别金银花的真品、伪品及混杂品，在未破坏金银花样本组织结构及材质的情况下，可有效辨别金银花真伪，具有较强的优良性，更值得进一步推广和应用。
参考文献
[1]蒋超，侯静怡，黄璐琦，等.快速PCR方法在金银花真伪鉴别中的应用[J].中国中药杂志，2014，39（19）：3668-3672.
[2]蒋超，黄璐琦，袁媛，等.金银花中几种分子的真伪鉴别方法比较及其研究进展[J].世界科学技术：中医药现代化，2014，16（8）：1831-1839.
[3]崔占虎，蒋超，黄璐琦，等.断肠草与金银花类药材水提液特异性PCR鉴定方法研究[J].中国中药杂志，2013，38（16）：2563-2566.
【关键词】 双向位点特异性PCR 金银花 真伪鉴别
金银花又名忍冬，药科金银花属忍冬科忍冬属植物及同属植物干燥花蕾或带初开的花，外貌上形似于华南忍冬，具有清热解毒之功效。伪品金银花[1-2]主要包括苦糖果、金银木，且无正品金银花的药效，如被误当真品服用，将会延误治疗。因此，采用正确的方法对其真伪进行辨别尤为重要。本文选取来自11个产地的88份植物样本为研究对象，对双向位点特异性PCR鉴别金银花真伪的重要价值进行评价，具体如下。
1 材料与方法
1.1 材料
选取来自山东平邑、河南封丘、河北巨鹿、广西马山、湖南隆回及湖北、江西、广东、重庆、陕西、江西11个产地的88份植物样本为研究对象，所选样本主要包括忍冬32个，华南忍冬6个，灰毡毛忍冬8个，黄褐毛忍冬8个，水忍冬12个，金银忍冬6个，繁果忍冬7个，红腺忍冬9个。所有药材均经相关部门批准，符合药材选择标准[1]。同时，选取购自市场上经炮制的药材进行双向位点特异性PCR鉴别。
1.2 仪器与试剂
1.2.1 仪器
选用东胜龙二代ETC811新款PCR仪为检测仪器，温度为0-105℃，热盖温度30-110℃，显示精度为0.1℃，温度准确度性为±0.1℃@55℃，温度均一性为<0.3℃@55℃，温度梯度为5℃/s，梯度跨度为1-42℃，输入电压为AC220V（±10%）50/60Hz。选用Eppendorf小型台式冷冻高速离心机5427R，温度范围为-11℃～40℃，离心计时为10s-10h，最大功率为550W，最大容量为48×1.5/2.0ml。选用Biorad伯乐凝胶成像系统，检测器为CCD，像素为4.65×4.65μm，像素密度为4096，工作湿度为<70%，工作温度为10-28℃。
1.2.2 试剂
SunShineBio琼脂糖（原产于西班牙，供应商：南京生兴生物技术有限公司）；Sigma-Aldric溴化乙啶（原产于美国，供应商：北京基尼亚生物技术有限公司）；Promega聚合酶（保定市凌业商贸有限公司）。
1.3 方法
观察组：取干燥材料100mg，并提取入选材料的DNA，不同样品的DNA浓度约为10mg/L，利用引物（trnF、trnL，各0.2pmol）对PCR反应及DNA质量进行检测。在PCR扩增仪上进行反应，待反应结束后在反应体系中增加适量缓冲剂，待混合均匀后在EB染色的1%琼脂酸凝胶点上检测，并使用凝胶成像系统进行系统化的观察。
对照组：取该品粉末0.2g，加入5ml甲醇，并将其放置12小时后过滤溶液，使用照高效液相色谱法对金银花含量进行检测。
1.4 统计学方法
本研究所有数据均采用SPSS13.0统计软件进行数据统计，计量资料用（x+s）进行表示，计数资料用%表示，P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 SNP位点的筛选与引物
根据数据库中显示的忍冬属植物的叶绿体序列，并使用软件对比不同序列间的内在联系，对忍冬属植物的trnF-trnL序列进行分析，结果显示trnF-trnL序列的625位均为G，而其他物种均为A。以SNP为主要位点，双向位点特异性PCR引物的序列情况如表1所示。
2.2 双向位点特异性PCR反应条件
在建立单侧位点特异性PCR的基础上设计另一侧的引物，并优化反应循环数目及内侧与外侧的引物浓度，确定Bi-PASA的反应条件。实验研究结果表明，对APRMS分型产生影响的相关因素较多，其中包括退火温度、Tap酶种类、用量等，且金银花的使用量相对较低。但由于Bi-PASA所使用巢式引物极易造成正常的PCR扩增过程受限，因此，将Bi-PASA内外侧的比例优化为3：1，此时，金银花Bi-PASA的结果最佳。
2.3 金银花真伪
当退火温度为61℃时，真品金银花条带为468hp，伪品条带为324hp，正品金银花中掺杂5%以上伪品可同时出现正品与伪品条带。
2.4 两种鉴别方法的鉴别时间比较
观察组的鉴别所用时间为（3.56±1.25）h，对照组的鉴别所用时间为（11.25±2.96）h，观察组明显优于对照组，两组组件有显著差异（P<0.05）。
3 讨论
本次研究结果显示，两组在鉴别结果上午明显差异（P>0.05）；观察组的鉴别时间短于对照组（P<0.05）。本结果与相关研究结果相符[3]。
综上所述，双向位点特异性PCR检测技术可有效辨别金银花的真品、伪品及混杂品，在未破坏金银花样本组织结构及材质的情况下，可有效辨别金银花真伪，具有较强的优良性，更值得进一步推广和应用。
参考文献
[1]蒋超，侯静怡，黄璐琦，等.快速PCR方法在金银花真伪鉴别中的应用[J].中国中药杂志，2014，39（19）：3668-3672.
[2]蒋超，黄璐琦，袁媛，等.金银花中几种分子的真伪鉴别方法比较及其研究进展[J].世界科学技术：中医药现代化，2014，16（8）：1831-1839.
[3]崔占虎，蒋超，黄璐琦，等.断肠草与金银花类药材水提液特异性PCR鉴定方法研究[J].中国中药杂志，2013，38（16）：2563-2566.