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摘要： 狗牙根中含有丰富的纤维素，经纤维素酶酶解形成的还原糖通过嗜鞣管囊酵母发酵可以得到生物乙醇。以狗牙根为原料，分析嗜鞣管囊酵母发酵过程中培养时间、接种量、pH值、温度等因素对乙醇得率的影响，探索最佳的发酵工艺条件。结果表明， pH值为5 0、温度40 ℃、嗜鞣管囊酵母菌液（1亿个/mL）接种量0 073 0 mL/g、发酵时间 60 h 为生产乙醇的最佳条件，此时乙醇浓度为5 146 mg/mL。
关键词： 生物乙醇；嗜鞣管囊酵母；发酵；纤维素；狗牙根
中图分类号：TQ352 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2015）08-0384 02
21世纪，社会经济飞速发展，对能源的需求也越来越大，[JP 1]以煤炭为主的能源消耗结构是我国空气质量不断恶化的主要原因 [1]，寻找新的替代能源是当务之急。生物乙醇是一种新型能源，然而最初生物乙醇的生产主要以玉米、小麦为原料，不仅消耗大量农产品，成本高，而且威胁到国家的粮食安全，影响粮食的正常供应，导致农产品价格上涨等连锁反应 [2-3]。因此，第2代利用纤维素生产生物乙醇的技术引起较大关注 [4]，这不仅可以大大缓解能源压力，也可以避免人和能源之间的争粮现象。狗牙根含有丰富的纤维素，经稀酸预处理，在纤维素酶和木聚糖酶作用下可降解得到还原糖，接种嗜鞣管囊酵母发酵可制备生物乙醇。本试验通过研究pH值、时间、温度、嗜鞣管囊酵母接种量等因素对狗牙根糖化液发酵产生乙醇得率的影响，通过正交试验探索狗牙根糖化液制备乙醇的最佳发酵条件，为狗牙根的开发利用提供科学依据。
1 材料与方法
1 1 试验材料
从河南城建学院图书馆后的山脚下采集成熟的狗牙根（Bermuda grass）植株，洗净烘干，用粉碎机粉碎，过60目筛，密封保存，备用。
1 2 主要试剂
葡萄糖、盐酸、氢氧化钠，天津市博迪化工有限公司产品；酵母膏、蛋白胨，北京奥博星生物技术有限责任公司产品；纤维素酶、木聚糖酶，和氏璧生物技术有限公司产品。
1 3 试验仪器
QE-100屹立高速中药粉碎机，武义县屹立工具有限公司生产；FA1004B电子天平，上海越平科学仪器有限公司生产；HWS28型电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司生产；LDZX-75KBS立式电热压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂生产；PHSJ-3F pH计，上海精密科学仪器有限公司生产；T6新世纪紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司生产；ZFD-A5250生化培养箱、HZQ-L恒温培养摇床，上海智城分析仪器制造有限公司生产。
1 4 试验方法
1 4 1 pH值测定 称取狗牙根粉末1 g，加入 1%稀盐酸，120 ℃反应60 min；调节pH值为4 2，加入木聚糖酶和纤维素酶酶解，测还原糖的量；根据还原糖含量配制液体培养基，分别调pH值为4 0、4 5、5 0、5 5、6 0；灭菌，接种嗜鞣管囊酵母菌液（1亿个/mL）0 094 9 mL/g，30 ℃摇床培养36 h；蒸馏测定乙醇含量。
1 4 2 温度测定 称取狗牙根粉末1 g分装在试管中，加入 1%稀盐酸，120 ℃反应60 min；调节pH值为4 2，加入木聚糖酶和纤维素酶酶解，根据还原糖含量配制液体培养基，调pH值为5 5；灭菌，接种菌液0 094 9 mL/g，分别放于20、25、30、35、40 ℃摇床中培养36 h；蒸馏测定乙醇含量。
1 4 3 接种量测定 称取狗牙根粉末1 g分装在试管中，加入 1%稀盐酸，120 ℃反应60 min；调节pH值为4 2，加入木聚糖酶和纤维素酶酶解，根据还原糖含量配制液体培养基，调pH值为5 5；灭菌，分别接种菌液0 029 2、0 051 1、0 073 0、0 094 9、0 116 8 mL/g，放于30 ℃摇床中培养36 h；蒸馏测定乙醇含量。
1 4 4 时间测定 称取1 g狗牙根粉末分装在试管中，加入 1%稀盐酸，120 ℃反应60 min；调节pH值为4 2，加入木聚糖酶和纤维素酶酶解，根据还原糖含量配制液体培养基，调pH值为5 5；灭菌，接种菌液0 094 9 mL/g，放于30 ℃摇床中分别培养36、48、60、72、84 h；蒸馏测定乙醇含量。
1 4 5 正交试验 在单因素试验基础上设计4因素3水平正交试验（表1），分析狗牙根纤维素发酵制备生物乙醇的最优工艺条件。
2 结果与分析
2 1 单因素试验
2 1 1 pH值对嗜鞣管囊酵母发酵产量的影响 由图1可见，嗜鞣管囊酵母适于在pH值为 4 5～5 0的酸性环境中生长；pH值为5 0时，生产出的乙醇浓度相对较高，为 2 259 mg/mL。pH值改变不太剧烈时，酶虽未变性，但会影响酶分子活性部位有关基团的解离，从而进一步影响酶与底物的结合或催化，使酶活性降低，也可能影响中间络合物ES的解离状态，不利于催化生成产物 [5]。因此，低于或高于最适pH值，都会影响乙醇的产量。
2 1 2 温度对嗜鞣管囊酵母发酵产量的影响 温度能够影响蛋白质、核酸等生物大分子的结构功能及细胞结构，而细胞膜的流动性及完整性均可影响微生物的生长、繁殖和代谢 [6]。由图2可见，温度过低或过高都会影响细胞生长，进而影响乙醇的得率；35 ℃时，菌株活力相对最为活跃，细胞膜的流动性达到最佳状态，此时发酵液中乙醇浓度相对较高，为4 076 mg/mL；20 ℃时，菌种的发酵能力欠佳，生长速度比较缓慢，生长周期延长，积累的代谢产物乙醇产量相对较低。2 1 3 接种量对嗜鞣管囊酵母发酵产量的影响 由图3可见，随着接种量增加，乙醇得率也逐渐升高，接种量为 0 094 9 mL/g 时，乙醇的得率相对最高，为1 02 mg/mL；接种量过低，由于没有足够的酵母细胞进行发酵生产，培养基中的营养物质未得到充分利用，从而影响乙醇的得率。由于接种到新鲜培养液的种子细胞，一时缺乏分解或催化有关底物的酶或辅酶，或是缺乏充足的中间代谢物，在实际菌种生长过程中会产生诱导酶或合成有关的中间代谢物 [7-8]，这就需要有一段用于适应的时间，出现延滞期。在发酵工业中，为缩短延滞期以缩短生产周期，通常都会采用较大的接种量。但是，如果接种量过高，培养基既要满足菌体生长，又要用于生产乙醇，反而会使乙醇的产量下降。2 1 4 发酵时间对嗜鞣管囊酵母发酵产量的影响 菌种发酵生产乙醇需要一个合理的发酵周期，发酵时间直接影响着乙醇的产量。由图4可见，嗜鞣管囊酵母发酵培养的最佳时间为60 h，此时，发酵液中乙醇浓度为相对最高，为 2 442 mg/mL；发酵72 h时，发酵液中乙醇浓度有所降低，这是因为嗜鞣管囊酵母发酵初期以发酵液中的葡萄糖为碳源，酵母不断代谢葡萄糖发酵成乙醇，而管囊酵母同化乙醇的能力很强 [9]；发酵超过72 h，发酵液中的葡萄糖含量减少，酵母可能开始利用乙醇为碳源来维持自身的生长和繁殖。 2 2 正交试验与工艺优化
由表2可见，影响乙醇产物得率的最关键因素是发酵温度；嗜鞣管囊酵母发酵狗牙根生成乙醇的最佳条件为A2B3C1D2，即pH值为5 0、温度40 ℃、接种量0 073 0 mL/g、时间60 h，此时，乙醇浓度最高，为5 146 mg/mL。
3 讨论
目前，纤维素生产乙醇的研究主要集中于预处理方法的选择、工艺的优化、酶水解成本的降低及乙醇转化率的提高。利用预处理和双酶降解纤维素后的还原糖为原料，接种单一的嗜鞣管囊酵母发酵制备乙醇，乙醇的得率往往相对较低，而多菌种混合发酵可充分利用培养基中的有效成分，提高乙醇的得率，这为进一步提高产量提供了依据 [10]。
参考文献：
[1] 马春红，李运朝，刘 旭，等 生物质能源研究进展与前景展望[J] 河北农业科学，2011，15（3）：117-121
[2]鹿建光，童莉霞，李艳君 我国生物燃料乙醇产业现状及发展政策研究[J] 经济研究参考，2008（43）：10-18
[3]丁声俊 我国发展生物燃料乙醇的长久大计[J] 粮食与食品工业，2010，17（3）：1-5
[4]林向阳，阮榕生，李资玲，等 利用纤维素制备燃料酒精的研究[J] 可再生能源，2005（6）：51-54
[5]武玉学，靳 挺，王 强 嗜鞣管囊酵母发酵柑橘皮水解液生产乙醇的研究[J] 中国食品学报，2011，11（5）：32-36
[6]代金龙，宋昕磊，张 鹏 管囊酵母D-21木糖乙醇发酵条件的优化[J] 北京化工大学学报：自然科学版，2010，37（5）：98-102
[7]傅致远 生物质制取燃料乙醇的研究[J] 化学工程与装备，2013（12）：42-44
[8]张 越，聂莉莉，宋 建，等 木质纤维素为原料的燃料乙醇预处理技术研究进展[J] 天津农业科学，2011，17（4）：113-116
[9]田毅红，雷照方，龚大春 管囊酵母发酵生产乙醇的试验研究[J] 酿酒科技，2008（1）：45-47
[10] 田 沈，蔺增曦，姚滢秋，等 嗜鞣管囊酵母（Pachysolen tannophilus 1622）和重组大肠杆菌（E coli pGM-PA）乙醇发酵特性研究[J] 太阳能学报，2008，29（1）：95-99
关键词： 生物乙醇；嗜鞣管囊酵母；发酵；纤维素；狗牙根
中图分类号：TQ352 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2015）08-0384 02
21世纪，社会经济飞速发展，对能源的需求也越来越大，[JP 1]以煤炭为主的能源消耗结构是我国空气质量不断恶化的主要原因 [1]，寻找新的替代能源是当务之急。生物乙醇是一种新型能源，然而最初生物乙醇的生产主要以玉米、小麦为原料，不仅消耗大量农产品，成本高，而且威胁到国家的粮食安全，影响粮食的正常供应，导致农产品价格上涨等连锁反应 [2-3]。因此，第2代利用纤维素生产生物乙醇的技术引起较大关注 [4]，这不仅可以大大缓解能源压力，也可以避免人和能源之间的争粮现象。狗牙根含有丰富的纤维素，经稀酸预处理，在纤维素酶和木聚糖酶作用下可降解得到还原糖，接种嗜鞣管囊酵母发酵可制备生物乙醇。本试验通过研究pH值、时间、温度、嗜鞣管囊酵母接种量等因素对狗牙根糖化液发酵产生乙醇得率的影响，通过正交试验探索狗牙根糖化液制备乙醇的最佳发酵条件，为狗牙根的开发利用提供科学依据。
1 材料与方法
1 1 试验材料
从河南城建学院图书馆后的山脚下采集成熟的狗牙根（Bermuda grass）植株，洗净烘干，用粉碎机粉碎，过60目筛，密封保存，备用。
1 2 主要试剂
葡萄糖、盐酸、氢氧化钠，天津市博迪化工有限公司产品；酵母膏、蛋白胨，北京奥博星生物技术有限责任公司产品；纤维素酶、木聚糖酶，和氏璧生物技术有限公司产品。
1 3 试验仪器
QE-100屹立高速中药粉碎机，武义县屹立工具有限公司生产；FA1004B电子天平，上海越平科学仪器有限公司生产；HWS28型电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司生产；LDZX-75KBS立式电热压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂生产；PHSJ-3F pH计，上海精密科学仪器有限公司生产；T6新世纪紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司生产；ZFD-A5250生化培养箱、HZQ-L恒温培养摇床，上海智城分析仪器制造有限公司生产。
1 4 试验方法
1 4 1 pH值测定 称取狗牙根粉末1 g，加入 1%稀盐酸，120 ℃反应60 min；调节pH值为4 2，加入木聚糖酶和纤维素酶酶解，测还原糖的量；根据还原糖含量配制液体培养基，分别调pH值为4 0、4 5、5 0、5 5、6 0；灭菌，接种嗜鞣管囊酵母菌液（1亿个/mL）0 094 9 mL/g，30 ℃摇床培养36 h；蒸馏测定乙醇含量。
1 4 2 温度测定 称取狗牙根粉末1 g分装在试管中，加入 1%稀盐酸，120 ℃反应60 min；调节pH值为4 2，加入木聚糖酶和纤维素酶酶解，根据还原糖含量配制液体培养基，调pH值为5 5；灭菌，接种菌液0 094 9 mL/g，分别放于20、25、30、35、40 ℃摇床中培养36 h；蒸馏测定乙醇含量。
1 4 3 接种量测定 称取狗牙根粉末1 g分装在试管中，加入 1%稀盐酸，120 ℃反应60 min；调节pH值为4 2，加入木聚糖酶和纤维素酶酶解，根据还原糖含量配制液体培养基，调pH值为5 5；灭菌，分别接种菌液0 029 2、0 051 1、0 073 0、0 094 9、0 116 8 mL/g，放于30 ℃摇床中培养36 h；蒸馏测定乙醇含量。
1 4 4 时间测定 称取1 g狗牙根粉末分装在试管中，加入 1%稀盐酸，120 ℃反应60 min；调节pH值为4 2，加入木聚糖酶和纤维素酶酶解，根据还原糖含量配制液体培养基，调pH值为5 5；灭菌，接种菌液0 094 9 mL/g，放于30 ℃摇床中分别培养36、48、60、72、84 h；蒸馏测定乙醇含量。
1 4 5 正交试验 在单因素试验基础上设计4因素3水平正交试验（表1），分析狗牙根纤维素发酵制备生物乙醇的最优工艺条件。
2 结果与分析
2 1 单因素试验
2 1 1 pH值对嗜鞣管囊酵母发酵产量的影响 由图1可见，嗜鞣管囊酵母适于在pH值为 4 5～5 0的酸性环境中生长；pH值为5 0时，生产出的乙醇浓度相对较高，为 2 259 mg/mL。pH值改变不太剧烈时，酶虽未变性，但会影响酶分子活性部位有关基团的解离，从而进一步影响酶与底物的结合或催化，使酶活性降低，也可能影响中间络合物ES的解离状态，不利于催化生成产物 [5]。因此，低于或高于最适pH值，都会影响乙醇的产量。
2 1 2 温度对嗜鞣管囊酵母发酵产量的影响 温度能够影响蛋白质、核酸等生物大分子的结构功能及细胞结构，而细胞膜的流动性及完整性均可影响微生物的生长、繁殖和代谢 [6]。由图2可见，温度过低或过高都会影响细胞生长，进而影响乙醇的得率；35 ℃时，菌株活力相对最为活跃，细胞膜的流动性达到最佳状态，此时发酵液中乙醇浓度相对较高，为4 076 mg/mL；20 ℃时，菌种的发酵能力欠佳，生长速度比较缓慢，生长周期延长，积累的代谢产物乙醇产量相对较低。2 1 3 接种量对嗜鞣管囊酵母发酵产量的影响 由图3可见，随着接种量增加，乙醇得率也逐渐升高，接种量为 0 094 9 mL/g 时，乙醇的得率相对最高，为1 02 mg/mL；接种量过低，由于没有足够的酵母细胞进行发酵生产，培养基中的营养物质未得到充分利用，从而影响乙醇的得率。由于接种到新鲜培养液的种子细胞，一时缺乏分解或催化有关底物的酶或辅酶，或是缺乏充足的中间代谢物，在实际菌种生长过程中会产生诱导酶或合成有关的中间代谢物 [7-8]，这就需要有一段用于适应的时间，出现延滞期。在发酵工业中，为缩短延滞期以缩短生产周期，通常都会采用较大的接种量。但是，如果接种量过高，培养基既要满足菌体生长，又要用于生产乙醇，反而会使乙醇的产量下降。2 1 4 发酵时间对嗜鞣管囊酵母发酵产量的影响 菌种发酵生产乙醇需要一个合理的发酵周期，发酵时间直接影响着乙醇的产量。由图4可见，嗜鞣管囊酵母发酵培养的最佳时间为60 h，此时，发酵液中乙醇浓度为相对最高，为 2 442 mg/mL；发酵72 h时，发酵液中乙醇浓度有所降低，这是因为嗜鞣管囊酵母发酵初期以发酵液中的葡萄糖为碳源，酵母不断代谢葡萄糖发酵成乙醇，而管囊酵母同化乙醇的能力很强 [9]；发酵超过72 h，发酵液中的葡萄糖含量减少，酵母可能开始利用乙醇为碳源来维持自身的生长和繁殖。 2 2 正交试验与工艺优化
由表2可见，影响乙醇产物得率的最关键因素是发酵温度；嗜鞣管囊酵母发酵狗牙根生成乙醇的最佳条件为A2B3C1D2，即pH值为5 0、温度40 ℃、接种量0 073 0 mL/g、时间60 h，此时，乙醇浓度最高，为5 146 mg/mL。
3 讨论
目前，纤维素生产乙醇的研究主要集中于预处理方法的选择、工艺的优化、酶水解成本的降低及乙醇转化率的提高。利用预处理和双酶降解纤维素后的还原糖为原料，接种单一的嗜鞣管囊酵母发酵制备乙醇，乙醇的得率往往相对较低，而多菌种混合发酵可充分利用培养基中的有效成分，提高乙醇的得率，这为进一步提高产量提供了依据 [10]。
参考文献：
[1] 马春红，李运朝，刘 旭，等 生物质能源研究进展与前景展望[J] 河北农业科学，2011，15（3）：117-121
[2]鹿建光，童莉霞，李艳君 我国生物燃料乙醇产业现状及发展政策研究[J] 经济研究参考，2008（43）：10-18
[3]丁声俊 我国发展生物燃料乙醇的长久大计[J] 粮食与食品工业，2010，17（3）：1-5
[4]林向阳，阮榕生，李资玲，等 利用纤维素制备燃料酒精的研究[J] 可再生能源，2005（6）：51-54
[5]武玉学，靳 挺，王 强 嗜鞣管囊酵母发酵柑橘皮水解液生产乙醇的研究[J] 中国食品学报，2011，11（5）：32-36
[6]代金龙，宋昕磊，张 鹏 管囊酵母D-21木糖乙醇发酵条件的优化[J] 北京化工大学学报：自然科学版，2010，37（5）：98-102
[7]傅致远 生物质制取燃料乙醇的研究[J] 化学工程与装备，2013（12）：42-44
[8]张 越，聂莉莉，宋 建，等 木质纤维素为原料的燃料乙醇预处理技术研究进展[J] 天津农业科学，2011，17（4）：113-116
[9]田毅红，雷照方，龚大春 管囊酵母发酵生产乙醇的试验研究[J] 酿酒科技，2008（1）：45-47
[10] 田 沈，蔺增曦，姚滢秋，等 嗜鞣管囊酵母（Pachysolen tannophilus 1622）和重组大肠杆菌（E coli pGM-PA）乙醇发酵特性研究[J] 太阳能学报，2008，29（1）：95-99