基于多维液相色谱技术对人尿源性蛋白质组的高效分离大幅提升了蛋白质鉴定的序列覆盖度。采用强阴离子交换色谱(1stD-SAX)为第一维色谱、反相液相色谱(2ndD-RPLC)为第二维色谱，组成两维色谱高效分离系统。经过分离条件的选择和优化，建立了理论峰容量超过40000的两维色谱系统。根据实际鉴定能力和技术需求，在实际样品分离时，第一维收集50个馏分，第二维收集64个馏分，系统有效峰容量取值3200。在此基础上，对人尿蛋白质组进行了蛋白质水平分离和深度覆盖鉴定。收集一组健康志愿者的尿液样品，通过离心、超滤等前处理纯化制备样品。为了提高目标的针对性，所制备的样品先通过第一维的强阴离子交换色谱分离，选取了1stD-SAX分离的14号馏分（39～42 min）作为主要研究目标，将收集的14号馏分均分成两份，其中一份对其直接酶解鉴定，获得色谱质谱鉴定数据；另一份经过2ndD-RPLC分离并收集64个馏分，再逐个酶解，分别鉴定，获得色谱质谱数据。结果表明，以第14号馏分为对象，前者共鉴定出628种蛋白，后者64个馏分共鉴定出2440种蛋白。在两者共同鉴定出的588种蛋白中，增加第二维分离后的序列覆盖度显著提高。进一步的分析统计表明，经第二维分离后，长度不超过500个氨基酸的蛋白的序列覆盖度达到31.30%,相较仅采用第一维分离鉴定的覆盖度值提升了2.02倍；对于长度500以上且未超过1000个氨基酸的蛋白，第一维分离的序列覆盖度为7.79%,经第二维分离后，覆盖度提升至21.35%,覆盖度提高了2.74倍。对于由1000个以上氨基酸组成的较大分子量的蛋白质，第二维分离可将序列覆盖度进一步提升3.87倍。本研究结果验证了蛋白质经过多维色谱充分分离后，使用常见的Shotgun蛋白鉴定技术显著提高了鉴定覆盖度和可靠性。同时，质谱鉴定得到的肽段数量显著增加，减小了错配或漏配的概率，有助于获得蛋白质更完整、更精准的序列信息，对蛋白质组学深度覆盖鉴定、建立更加精准的蛋白质组数据库具有重要意义。