论文部分内容阅读
doi：10.3969/j.issn.1008-4754.2021.11.072
摘要：为了提高牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）的培养滴度，延长牛传染性鼻气管炎病毒液的保存时间，本研究对牛传染性鼻气管炎病毒增殖工艺进行了优化研究。研究结果表明：吸附或不吸附的接毒方式对病毒液的滴度没有明显的差异，而病毒液滴度与接毒前细胞数、病毒液收获时间呈正比;最佳的接毒剂量0.01%，收获病毒液的时间为细胞100%病变时，病毒液的滴度最高;使用保护剂2能够有效延长半成品病毒液的保存期（至12个月）。
关键词：牛传染性鼻气管炎病毒;接毒;病毒增殖;工艺研究
牛传染性鼻气管炎（infectious bovine rhinotracheitis，IBR）是由牛传染性鼻气管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）或Ⅰ型牛疱疹病毒（BHV-Ⅰ）引起的一种牛呼吸道接触性传染病，该病为二类传染病，又被称为“坏死性鼻炎”、“红鼻病”[1，2]，牛传染性鼻气管炎的临床特征为：呼吸困难、鼻腔流脓、鼻黏膜充血、结膜炎、乳腺炎、流产等症状[3-5]。Madin等[6]在1956年首次分离出病毒并被命名为牛传染性鼻气管炎，1964年又有学者确认牛鼻气管炎病毒属于疱疹病毒。该病最典型的特点为持续性，因此牛感染该病毒后会长期带毒甚至有可能会终生带毒，这严重制约了全世界养牛业的健康发展，对全球养牛业造成了一定的经济损失。接种疫苗是防控该病的最重要措施，而抗原是影响疫苗免疫效果的重要因素[7]，为了提高牛传染性鼻气管炎病毒的培养滴度，延长牛传染性鼻气管炎病毒液的保存时间，对牛传染性鼻气管炎病毒增殖工艺进行了研究，确定了最佳接毒法、接毒剂量、收获时间等工艺参数，并对病毒液保存条件、保存时间进行了相关的研究。
1 材料与方法
1.1 细胞和病毒株
MDBK细胞，牛传染性鼻气管炎病毒（C1株）均由瑞普（保定）生物药业有限公司种毒室提供。
1.2 试剂
DMEM培养基购自GIBCO公司，新生牛血清购自内蒙古金源康生物工程公司，病毒保护剂由合作单位惠赠。
1.3 牛传染性鼻气管炎病毒增殖条件的优化
1.3.1 最佳接毒时间的摸索 取牛传染性鼻气管炎（C1株）生产用种毒，按照万分之一接毒量接种至培养时间分别为24h、48h、72h的MDBK细胞。每组分别设置吸附组、不吸附组。吸附组接毒方法为接毒后置于37℃吸附1h，补加维持液至1L，于37℃继续培养;不吸附组接毒方法为接毒后补加维持液至1L，于37℃继续培养。当细胞病变达到80%以上时收获病毒液。
1.3.2 最佳接毒剂量、收获时间的摸索 取牛传染性鼻气管炎（C1株）生产用种毒，分不同接毒量接种至已长满良好单层的制苗用细胞，接毒量分别为50μL、100μL和200μL三个梯度，补加维持液至1L后于37℃继续培养。取牛传染性鼻气管炎（C1株）生产用种毒，接种至已长满良好单层的制苗用细胞，并补加维持液，于37℃继续培养。按照不同收获时间收获牛传染性鼻气管炎病毒液，检测各样品病毒液效价。
1.3.3 病毒液保存期试验 将收获的牛传染性鼻气管炎病毒液冻融三次后，按病毒液与病毒储存液10000：1的体积比（V：V），在病毒液中加入病毒储存液，充分混匀后，置于-20℃保存。同时设立不加储存液的对照。
2 结果
2.1 最佳接毒时间试验结果
如表1显示吸附和不吸附对所收获病毒液的滴度没有太大的影响，吸附组病毒液滴度最高为107.5TCID50/0.1mL，不吸附组病毒液滴度最高为107.7TCID50/0.1mL。病毒液滴度与接毒前细胞数、病毒液收获时间呈正比，即接毒前细胞数越多，病毒液收获需要的时间越长，病毒液滴度越高。故优选细胞培养72h长成致密单层后接毒，不吸附，待病变细胞超过80%后收获病毒液。
2.2 最佳接毒剂量、收获时间试验结果
下表的结果显示：①接毒量不同对牛传染性鼻气管炎病毒液的收获时间有较大的影响，接毒量大则收获时间提前;②接毒量不同对牛传染性鼻气管炎病毒液滴度的影响较小;③收获时病变程度越高，收获的病毒液滴度也就越高：萬分之零点五的接毒量使细胞达到100%的病变程度所需要的时间为50h，而0.02%的接毒量使细胞达到100%的病变程度需要的时间为42h，则两者相差8h;④接毒量为0.005%、0.01%、0.02%时，细胞达到100%病变时所收获病毒液的滴度分别为107.5、108.0和107.8TCID50/0.1mL;⑤由下表也可看出当各个接毒量均显示病变程度越高时，病毒液的滴度则越高，因此优选最佳的接毒量为0.01%，收获病毒液的时间为细胞100%病变时。
2.3 病毒液保存期试验结果
结果显示添加病毒储存液的病毒液在-20℃的条件下保存12个月后病毒含量下降均不超过1.0 lg（TCID50/0.1mL）;而对照组病毒含量迅速下降，其保存4个月后病毒含量已低于“规程”要求（制苗用的半成品病毒液病毒含量应≥6.5 lg（TCID50/0.1mL），为不合格产品。因此，添加保护剂2能够有效延长半成品病毒液的保存期（至12个月）。
3 讨论
牛传染性鼻气管炎属于二类疫病，是一种急性、热性传染病，感染该病后对奶牛的奶质、肉牛的肉质、母牛的繁殖力和幼牛的生长发育产生了严重的影响，对养殖场及养殖业造成了巨大的经济损失。而对于该疫病的防控措施是重中之重，目前采取免疫疫苗的方式来防治疫病是一项重要的措施，而影响疫苗免疫效果的最重要因素为病毒液的滴度，本研究针对牛传染性鼻气管炎病毒制备工艺中的各个参数进行了优化，确定了最佳接毒时间、接种比例和收获时间，以获得较高的病毒滴度，并优选了一种病毒保护剂，有效延长了半成品病毒液的保存期。 牛传染性鼻气管炎属于疱疹病毒科，而疱疹病毒侵入细胞的方式不止是细胞的吞噬作用，可能病毒囊膜与细胞膜的融合是病毒进入细胞的主要方式[8]。而细胞数越多膜面积也越大，从而进入细胞的病毒量也越多，而细胞病变越多所释放出来的病毒也就越多，因此正如结果所示，病毒液的病毒滴度与接毒前细胞数和病毒液的收获时间呈正比。
4 结论
对牛传染性鼻气管炎病毒的制备工艺进行了优化研究，确定了最佳接毒时间为：细胞培养72h长成致密单层细胞后接毒且不吸附，接种比例为0.01%，收获时间为细胞100%病变，以此收获的病毒液滴度可稳定在7.5 lg（TCID50/0.1mL）以上;优选了一种病毒保护剂，有效延长了半成品病毒液的保存期。
参考文献：
[1] Raaperi K， Orro T， Viltrop A. Epidemiology and control of bovine herpesvirus 1 infection in Europe[J]. Veterinary Journal， 2014， 201（3）：249-256.
[2] Xu J， Li X Y， Jiang B， et al. Antiviral immunotoxin against bovine herpesvirus-1：targeted inhibition of viral replication and apoptosis of infected cell[J]. Frontires in microbiology， 2018， 9：653.
[3] Wentink G H， Van Oirschot J T， Verhoeff J. Risk of infection with bovine herpesvirus 1 （BHV1）： a review[J]. Vet Q， 1993， 15（1）：30-33.
[4] Porter D D， Larsen A E， Cox N A. Isolation of infectious rhinotracheitis virus frome mustelidae[J]. Clin Microbiol， 1975， 1（1）：112-113.
[5] Nandi S， Kumar M， Manohar M， et al. Bovine herpes virus infectious in cattle[J]. Anim Health Res Rev， 2009， 10（1）：85-98.
[6] Madin S H， Mckercher D G， York C J. Isolation of the infectious bovine rhinotracheitis virus[J]. Science， 1956， 124（3225）：721-722.
[7] Kaashoek M J， Moerman A， Madie J A， et al. An inactivated vaccine based on a glycoprotein Enegative strain of bovine herpes virus 1 induees protective immunity and allows serological differentiation[J]. Vaccine， 1995， 13（4）：342-346.
[8] 王曉，丁明孝，戎宪辉，等.细胞松弛素B对牛传染性鼻气管炎病毒感染与复制的影响[J].病毒学报，1985，1（3）：242-246.
*通讯作者：郁宏伟（1979— ），高级兽医师，博士，研究方向为畜禽疫病防控。
摘要：为了提高牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）的培养滴度，延长牛传染性鼻气管炎病毒液的保存时间，本研究对牛传染性鼻气管炎病毒增殖工艺进行了优化研究。研究结果表明：吸附或不吸附的接毒方式对病毒液的滴度没有明显的差异，而病毒液滴度与接毒前细胞数、病毒液收获时间呈正比;最佳的接毒剂量0.01%，收获病毒液的时间为细胞100%病变时，病毒液的滴度最高;使用保护剂2能够有效延长半成品病毒液的保存期（至12个月）。
关键词：牛传染性鼻气管炎病毒;接毒;病毒增殖;工艺研究
牛传染性鼻气管炎（infectious bovine rhinotracheitis，IBR）是由牛传染性鼻气管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）或Ⅰ型牛疱疹病毒（BHV-Ⅰ）引起的一种牛呼吸道接触性传染病，该病为二类传染病，又被称为“坏死性鼻炎”、“红鼻病”[1，2]，牛传染性鼻气管炎的临床特征为：呼吸困难、鼻腔流脓、鼻黏膜充血、结膜炎、乳腺炎、流产等症状[3-5]。Madin等[6]在1956年首次分离出病毒并被命名为牛传染性鼻气管炎，1964年又有学者确认牛鼻气管炎病毒属于疱疹病毒。该病最典型的特点为持续性，因此牛感染该病毒后会长期带毒甚至有可能会终生带毒，这严重制约了全世界养牛业的健康发展，对全球养牛业造成了一定的经济损失。接种疫苗是防控该病的最重要措施，而抗原是影响疫苗免疫效果的重要因素[7]，为了提高牛传染性鼻气管炎病毒的培养滴度，延长牛传染性鼻气管炎病毒液的保存时间，对牛传染性鼻气管炎病毒增殖工艺进行了研究，确定了最佳接毒法、接毒剂量、收获时间等工艺参数，并对病毒液保存条件、保存时间进行了相关的研究。
1 材料与方法
1.1 细胞和病毒株
MDBK细胞，牛传染性鼻气管炎病毒（C1株）均由瑞普（保定）生物药业有限公司种毒室提供。
1.2 试剂
DMEM培养基购自GIBCO公司，新生牛血清购自内蒙古金源康生物工程公司，病毒保护剂由合作单位惠赠。
1.3 牛传染性鼻气管炎病毒增殖条件的优化
1.3.1 最佳接毒时间的摸索 取牛传染性鼻气管炎（C1株）生产用种毒，按照万分之一接毒量接种至培养时间分别为24h、48h、72h的MDBK细胞。每组分别设置吸附组、不吸附组。吸附组接毒方法为接毒后置于37℃吸附1h，补加维持液至1L，于37℃继续培养;不吸附组接毒方法为接毒后补加维持液至1L，于37℃继续培养。当细胞病变达到80%以上时收获病毒液。
1.3.2 最佳接毒剂量、收获时间的摸索 取牛传染性鼻气管炎（C1株）生产用种毒，分不同接毒量接种至已长满良好单层的制苗用细胞，接毒量分别为50μL、100μL和200μL三个梯度，补加维持液至1L后于37℃继续培养。取牛传染性鼻气管炎（C1株）生产用种毒，接种至已长满良好单层的制苗用细胞，并补加维持液，于37℃继续培养。按照不同收获时间收获牛传染性鼻气管炎病毒液，检测各样品病毒液效价。
1.3.3 病毒液保存期试验 将收获的牛传染性鼻气管炎病毒液冻融三次后，按病毒液与病毒储存液10000：1的体积比（V：V），在病毒液中加入病毒储存液，充分混匀后，置于-20℃保存。同时设立不加储存液的对照。
2 结果
2.1 最佳接毒时间试验结果
如表1显示吸附和不吸附对所收获病毒液的滴度没有太大的影响，吸附组病毒液滴度最高为107.5TCID50/0.1mL，不吸附组病毒液滴度最高为107.7TCID50/0.1mL。病毒液滴度与接毒前细胞数、病毒液收获时间呈正比，即接毒前细胞数越多，病毒液收获需要的时间越长，病毒液滴度越高。故优选细胞培养72h长成致密单层后接毒，不吸附，待病变细胞超过80%后收获病毒液。
2.2 最佳接毒剂量、收获时间试验结果
下表的结果显示：①接毒量不同对牛传染性鼻气管炎病毒液的收获时间有较大的影响，接毒量大则收获时间提前;②接毒量不同对牛传染性鼻气管炎病毒液滴度的影响较小;③收获时病变程度越高，收获的病毒液滴度也就越高：萬分之零点五的接毒量使细胞达到100%的病变程度所需要的时间为50h，而0.02%的接毒量使细胞达到100%的病变程度需要的时间为42h，则两者相差8h;④接毒量为0.005%、0.01%、0.02%时，细胞达到100%病变时所收获病毒液的滴度分别为107.5、108.0和107.8TCID50/0.1mL;⑤由下表也可看出当各个接毒量均显示病变程度越高时，病毒液的滴度则越高，因此优选最佳的接毒量为0.01%，收获病毒液的时间为细胞100%病变时。
2.3 病毒液保存期试验结果
结果显示添加病毒储存液的病毒液在-20℃的条件下保存12个月后病毒含量下降均不超过1.0 lg（TCID50/0.1mL）;而对照组病毒含量迅速下降，其保存4个月后病毒含量已低于“规程”要求（制苗用的半成品病毒液病毒含量应≥6.5 lg（TCID50/0.1mL），为不合格产品。因此，添加保护剂2能够有效延长半成品病毒液的保存期（至12个月）。
3 讨论
牛传染性鼻气管炎属于二类疫病，是一种急性、热性传染病，感染该病后对奶牛的奶质、肉牛的肉质、母牛的繁殖力和幼牛的生长发育产生了严重的影响，对养殖场及养殖业造成了巨大的经济损失。而对于该疫病的防控措施是重中之重，目前采取免疫疫苗的方式来防治疫病是一项重要的措施，而影响疫苗免疫效果的最重要因素为病毒液的滴度，本研究针对牛传染性鼻气管炎病毒制备工艺中的各个参数进行了优化，确定了最佳接毒时间、接种比例和收获时间，以获得较高的病毒滴度，并优选了一种病毒保护剂，有效延长了半成品病毒液的保存期。 牛传染性鼻气管炎属于疱疹病毒科，而疱疹病毒侵入细胞的方式不止是细胞的吞噬作用，可能病毒囊膜与细胞膜的融合是病毒进入细胞的主要方式[8]。而细胞数越多膜面积也越大，从而进入细胞的病毒量也越多，而细胞病变越多所释放出来的病毒也就越多，因此正如结果所示，病毒液的病毒滴度与接毒前细胞数和病毒液的收获时间呈正比。
4 结论
对牛传染性鼻气管炎病毒的制备工艺进行了优化研究，确定了最佳接毒时间为：细胞培养72h长成致密单层细胞后接毒且不吸附，接种比例为0.01%，收获时间为细胞100%病变，以此收获的病毒液滴度可稳定在7.5 lg（TCID50/0.1mL）以上;优选了一种病毒保护剂，有效延长了半成品病毒液的保存期。
参考文献：
[1] Raaperi K， Orro T， Viltrop A. Epidemiology and control of bovine herpesvirus 1 infection in Europe[J]. Veterinary Journal， 2014， 201（3）：249-256.
[2] Xu J， Li X Y， Jiang B， et al. Antiviral immunotoxin against bovine herpesvirus-1：targeted inhibition of viral replication and apoptosis of infected cell[J]. Frontires in microbiology， 2018， 9：653.
[3] Wentink G H， Van Oirschot J T， Verhoeff J. Risk of infection with bovine herpesvirus 1 （BHV1）： a review[J]. Vet Q， 1993， 15（1）：30-33.
[4] Porter D D， Larsen A E， Cox N A. Isolation of infectious rhinotracheitis virus frome mustelidae[J]. Clin Microbiol， 1975， 1（1）：112-113.
[5] Nandi S， Kumar M， Manohar M， et al. Bovine herpes virus infectious in cattle[J]. Anim Health Res Rev， 2009， 10（1）：85-98.
[6] Madin S H， Mckercher D G， York C J. Isolation of the infectious bovine rhinotracheitis virus[J]. Science， 1956， 124（3225）：721-722.
[7] Kaashoek M J， Moerman A， Madie J A， et al. An inactivated vaccine based on a glycoprotein Enegative strain of bovine herpes virus 1 induees protective immunity and allows serological differentiation[J]. Vaccine， 1995， 13（4）：342-346.
[8] 王曉，丁明孝，戎宪辉，等.细胞松弛素B对牛传染性鼻气管炎病毒感染与复制的影响[J].病毒学报，1985，1（3）：242-246.
*通讯作者：郁宏伟（1979— ），高级兽医师，博士，研究方向为畜禽疫病防控。