论文部分内容阅读
目的:磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phosphatidylinositol-3-kinase-protein kinase B-mammalian target of rapamycin,PI3K/Akt/mTOR)信号通路是自噬相关主要信号通路之一。自噬在硅沉着病纤维化形成过程中发挥关键作用。肺成纤维细胞向肌成纤维细胞表型转化是硅沉着病由炎症期进入纤维化期的标志之一。本研究旨在探讨PI3K/Akt/mTOR通路是否通过介导巨噬细胞自噬影响矽尘诱导的肺成纤维细胞向肌成纤维细胞表型转化。方法:采用100 ng/mL佛波酯诱导人单核细胞白血病细胞系THP-1细胞24 h获得巨噬细胞。以不同浓度(0、25、50、100、200、400μg/mL)二氧化硅(silicon dioxide,SiO2)粉尘悬浮液染毒巨噬细胞不同的时间(0、6、12、24、48 h)。采用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)法检测巨噬细胞存活率,酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法检测巨噬细胞上清液中转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的含量。采用Transwell技术建立巨噬细胞和HFL-1细胞共培养体系,设空白对照组、SiO2组、LY294002组、SC79组、LY294002+SiO2组、SC79+SiO2组。LY294002+SiO2组、SC79+SiO2组分别用LY294002(PI3K抑制剂)、SC79(Akt激活剂)预处理巨噬细胞18 h、24 h,再用SiO2(100μg/mL)粉尘悬浮液染毒巨噬细胞12 h。采用免疫荧光法检测巨噬细胞中微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)的表达情况;蛋白印迹法检测巨噬细胞PI3K、Akt、mTOR、Beclin-1、LC3的蛋白质表达水平及HFL-1细胞中Ⅲ型胶原蛋白(collagen Ⅲ,Col Ⅲ)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、纤维连接蛋白(fibronectin,FN)、基质金属蛋白酶-1(matrix metalloproteinase-1,MMP-1)、金属蛋白酶组织抑制因子-1(tissue matrix metalloproteinase inhibitor-1,TIMP-1)的蛋白质表达水平。结果:用不同浓度的SiO2粉尘悬浮液染毒巨噬细胞12 h,巨噬细胞的存活率随SiO2浓度的增加逐渐降低,与0μg/mL组比较,100、200、400μg/mL组细胞存活率均明显降低,细胞上清液中TGF-β1和TNF-α含量均明显增加(均P<0.05);用100μg/mL SiO2粉尘悬浮液染毒巨噬细胞,巨噬细胞的存活率随染毒时间的延长逐渐降低,与0 h组比较,6、12、24、48 h组细胞存活率明显降低(均P<0.05),细胞上清液中TGF-β1和TNF-α含量均明显增加,Beclin-1和LC3Ⅱ的蛋白质表达水平均明显上调(均P<0.05)。免疫荧光法结果显示:100μg/mL的SiO2粉尘处理巨噬细胞12 h后LC3的荧光呈点状聚集,且荧光强度明显高于空白对照组(P<0.05)。与空白对照组相比,SiO2组HFL-1细胞中Col Ⅲ、FN、α-SMA、MMP-1、TIMP-1的蛋白质表达均上调(均P<0.05);与SiO2组相比,LY294002+SiO2组中巨噬细胞PI3K、Akt、mTOR的蛋白质表达均下调(均P<0.05),LC3Ⅱ和Beclin-1的蛋白质表达均上调(均P<0.05),细胞上清液中TGF-β1和TNF-α含量均降低(均P<0.01),HFL-1细胞中Col Ⅲ、FN、α-SMA、MMP-1、TIMP-1的蛋白质表达均下调(均P<0.05);SC79+SiO2组巨噬细胞PI3K、Akt、mTOR的蛋白质表达均上调(均P<0.05),LC3Ⅱ和Beclin-1的蛋白质表达均下调(均P<0.05),细胞上清液中TGF-β1和TNF-α含量均增加(均P<0.01),HFL-1细胞中Col Ⅲ、FN、α-SMA、MMP-1、TIMP-1的蛋白质表达均上调(均P<0.05)。结论:矽尘染毒引起巨噬细胞的PI3K/Akt/mTOR通路抑制、自噬发生及炎症因子分泌增加,进而促进HFL-1细胞向肌成纤维细胞表型转化;调控PI3K/Akt/mTOR通路可通过影响矽尘对巨噬细胞的自噬诱导及炎症因子分泌,从而调节HFL-1细胞向肌成纤维细胞表型转化。