【摘 要】
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昆虫双杂交(Insect two-hybrid,I2H)技术是研究昆虫细胞蛋白质相互作用的一种方法.本研究利用Gateway克隆技术,构建了家蚕Bombyx mori蛋白BmHSP83和BmPDIA5,以及BmMAD3和BmMAN1的I2H载体;然后,将载体与报告质粒pUAS-Luc一起转染SF-9细胞,检测其发光值.结果表明,转染pIE2-AD-BmHSP83或pIE2-AD-BmMAD3载体与转染pUAS-Luc的对照组的细胞发光值无明显差异,报告基因未被激活;分别单独用pIE2-DBD-BmHSP8
【机 构】
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华南农业大学植物保护学院, 广州510642
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昆虫双杂交(Insect two-hybrid,I2H)技术是研究昆虫细胞蛋白质相互作用的一种方法.本研究利用Gateway克隆技术,构建了家蚕Bombyx mori蛋白BmHSP83和BmPDIA5,以及BmMAD3和BmMAN1的I2H载体;然后,将载体与报告质粒pUAS-Luc一起转染SF-9细胞,检测其发光值.结果表明,转染pIE2-AD-BmHSP83或pIE2-AD-BmMAD3载体与转染pUAS-Luc的对照组的细胞发光值无明显差异,报告基因未被激活;分别单独用pIE2-DBD-BmHSP83或pIE2-DBD-BmMAD3质粒转染细胞时,发光强度显著增加,报告基因被激活,说明BmHSP83和BmMAD3造成了假阳性结果;并且当细胞共转染pIE2-DBD-BmHSP83和pIE2-AD-BmPDIA5、pIE2-DBD-BmMAD3和pIE2-AD-BmMAN1时报告基因的激活反应显著提高,提示BmHSP83与BmPDIA5、BmMAD3与BmMAN1存在互作关系从而引起阳性反应,且与BmHSP83和BmMAD3的假阳性形成叠加效应;然而,当共转染pIE2-AD-BmHSP83和pIE2-DBD-BmPDIA5、pIE2-AD-BmMAD3和pIE2-DBD-BmMAN1时报告基因未被激活,显示pIE2-AD-BmHSP83/BmMAD3导致了假阴性.BmHSP83和BmMAD3引起I2H假性现象可能与该二种蛋白具有转录激活功能有关,当其与DNA结合结构域(DNA binding domain,DBD)融合表达时,该融合体即具备了DNA结合及转录激活两个功能,因而可以启动下游报告基因的表达;反之,当其与转录激活结构域(AD)融合表达时,则阻止了他们各自与BmPDIA5、BmMAN1蛋白的互作.本研究结果为那些利用I2H体系研究具有转录激活功能的蛋白质相互作用提供借鉴.
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