【摘 要】
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【目的】建立非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）ELISA抗体检测方法。【方法】以重组截短p72（p72s）蛋白作为检测抗原，通过方阵滴定法，确立ELISA的抗原、待检血清和酶标抗体的最佳工作浓度，优化抗原包被、酶标板封闭、血清/酶标抗体反应及底物显色等工作条件；应用受试者工作特征（receiver operating characteristic, RO
【机 构】
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河北农业大学动物医学院河北省兽医生物技术创新中心
【基金项目】
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河北省重点研发计划项目“非洲猪瘟病原学和血清学快速检测技术的研究及应用”（21326613D）； 河北省高等学校科学技术研究青年项目“非洲猪瘟病毒p72抗体检测ELISA方法的建立”（QN2022046）；
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【目的】建立非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）ELISA抗体检测方法。【方法】以重组截短p72（p72s）蛋白作为检测抗原，通过方阵滴定法，确立ELISA的抗原、待检血清和酶标抗体的最佳工作浓度，优化抗原包被、酶标板封闭、血清/酶标抗体反应及底物显色等工作条件；应用受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲线阈值评价标准，确定方法的阴阳性临界值；检测方法的特异性、敏感性、批内与批间重复性；最后分别用建立的ELISA方法和商品试剂盒检测124份血清，比较两者的阳性检出率，并通过Western blotting验证ELISA的检测结果。【结果】ELISA方法的抗原最佳包被浓度为0.5μg/mL,待检血清与酶标抗体的最适稀释度分别为1∶100和1∶5 000;反应条件为：抗原于37℃孵育1 h后经4℃包被酶标板过夜、于37℃封闭1 h或室温封闭2 h、待检血清和酶标抗体分别于37℃反应60和45 min及加入底物后于室温避光显色20 min;阴阳性血清的判定标准为：当待检血清的D450 nm值≥0.365时，判定为阳性；当D450 nm值＜0.365时，判定为阴性。该方法只与ASFV阳性血清发生特异性结合，与猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等病毒抗血清均无交叉反应；能检测到ASFV抗血清中的总蛋白量为0.091～0.153 mg/mL,低于商品试剂盒的最低检测量（0.110～0.554 mg/mL）;批内和批间重复性试验的平均变异系数分别为4.70%与5.125%。对临床血清样本检测时，建立方法和商品试剂盒的阳性检出率分别为75.81%（94/124）和32.26%（40/124）。进一步验证表明，Western blotting与ELISA的检测结果完全一致。【结论】建立了基于ASFV-p72s蛋白的ELISA抗体检测方法，该方法特异、敏感和重复性稳定，能够用于ASF临床诊断与流行病学调查，具有极大的开发应用潜力。
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