论文部分内容阅读
目前的细胞株生物学特性与临床标本不符,临床标本细胞成分复杂、正常与异常细胞共存,以上已成为制约套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma,MCL)发病机制研究的瓶颈。既往研究认为MCL来源于CD19阳性(CD19+)的成熟B细胞,而近期少许研究提示CD19阴性(CD19-)细胞可能是MCL的起源细胞,均预示MCL发病机制的复杂性。MCL恶性克隆发病机制研究严重不足,成为基础与临床研究急需解决的重要问题,导致这一问题的关键因素是优良细胞模型的匮乏。因此建立生物学特性与临床高度吻合的细胞株,将为打破发病机制研究实验瓶颈,为进一步研究其发病机制提供可能。目的1建立包含CD19+并极大富集CD19-早期阶段细胞,且生物学特性与临床高度吻合的MCL恶性克隆细胞株。2利用新建立的细胞模型进行MCL恶性克隆发病机制的研究,重点关注:MCL是单克隆还是多克隆肿瘤;恶性克隆生物学特性:聚焦异常发育阶段,免疫表型,基因表达、体内外肿瘤生物学特性。方法1 Je Ko-1-spheres细胞株的建立(1)球形生长方式的鉴定:流式检测比较Je Ko-1-parental细胞株球形生长及单个悬浮两种不同生长方式CD19的表达及边群细胞(side-population,SP)的比例。(2)采用原有培养体系连续培养自然纯化的方法建立Je Ko-1-spheres细胞株。2 Je Ko-1-spheres细胞株生物学特性的鉴定(1)流式细胞术多色分析CD19阴性细胞中CD34、CD38、TDT、CD22、CD5、CD10、Ig M表达并与正常对照比对鉴定Jeko-1-spheres免疫表型,并确定涉及的具体异常分化发育阶段。(2)qrt-PCR方法检测Je Ko-1-spheres及Je Ko-1-parental细胞株bcl-9、bcl-2、bcl-11b、c-myc、cyclin d1、bmi 1、sox2、CD133、nanog、bcl-11a及oct 2的基因表达差异。(3)Jeko-1-parental及Jeko-1-spheres行甲基纤维素克隆成球实验。(4)NOD/SCID小鼠行体内成瘤实验:选取胸腺、大脑、胸骨、肝脏、心肺、脾脏、肾、胃、肾上腺、肠道及胰腺进行H&E染色,脾脏行免疫组化,重点关注各器官成瘤、感染、出血及髓外造血的发生情况。3恶性克隆发病机制研究(1)流式分选Jeko-1-spheres、临床标本及正常标本中CD19-/Ig M-,CD19-/Ig M+、CD19+/Ig M+及CD19+/Ig M-(此组仅限正常标本)细胞行甲基纤维素克隆成球实验,14天后统计结果。(2)流式无菌分选临床来源样本及Jeko-1-spheres细胞中的三个目标亚克隆,分别行NOD/SCID小鼠体内致瘤实验。结果1建立Je Ko-1-spheres细胞株,具有与原代细胞一致的多细胞球体独特生长方式,并富集SP细胞及CD19-早期阶段细胞。2 MCL发病异常阶段可能涉及前B细胞、不成熟B细胞和成熟B细胞三个分化阶段,与其异常发育阶段相对应的恶性克隆免疫表型为:CD19-/Ig M-,CD19-/Ig M+,CD19+/Ig M+。3 Je Ko-1-spheres细胞株致癌潜力在癌基因及干性基因表达、克隆成球能力及体内致瘤能力上较Je Ko-1-parental细胞株均存在明显优势。4三个亚克隆体外克隆成球能力由强到弱一次为:CD19-/Ig M+>CD19+/Ig M+>CD19-/Ig M-;MCL较正常对照缺乏CD19+/Ig M-细胞亚群;三个亚克隆单独在体内均可成瘤但均未发生远处播散,其中以CD19-/Ig M+克隆体内感染出血发生率最高。结论1多细胞球体生长方式是套细胞淋巴瘤CD19-早期阶段恶性克隆的独特生长方式。2 Jeko-1-spheres细胞具有更强的致瘤能力,与临床标本高度一致的生物学特性,可以做为恶性克隆发病机理研究的细胞实验模型。3 MCL可能是发病机制涉及以下异常分化发育阶段即:前B、不成熟B、成熟B细胞三个连续发育阶段,与这些异常发育阶段相对应的恶性克隆免疫表型依次为:CD19-/Ig M-,CD19-/Ig M+,CD19+/Ig M+,该免疫表型与正常对照比对缺乏CD19+/Ig M-细胞亚群,存在明显分化发育差异,因此MCL可能是以CD19-/Ig M+为优势克隆的多克隆肿瘤。