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摘 要 选取水体中上、中、下层鱼（鲢、草鱼、鲫）并抽取其尾动脉血液，提取上清液，测定SOD活性。试验结果：鲢、草鱼、鲫的SOD活性分别是6.354 U·mL-1、2.394 U·mL-1、4.783 U·mL-1;其中草鱼的SOD活性显著低于鲢（P<0.05），草鱼与鲫间差异显著（P<0.05），鲢与鲫间差异显著（P<0.05）;鲢血液中SOD活性最高。
关键词 鲢;草鱼;鲫;血液;SOD活性
中图分类号：S965 文献标志码：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2021.25.002
超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）是国际公认的能够有效清除自由基的酶。在1969年被McCord和Fridovich在牛血红细胞中发现[1]，SOD是一种新型酶制剂，专一清除超氧阴离子（O2–）的关键酶。SOD在生物界分布極广，几乎从人到单细胞生物，从动物到植物，都有它的存在。SOD有多种抗氧化酶成分，能有效清除体内破坏健康、导致疾病的自由基，将其分解成对机体无害的氧分子和水分子，并顺利排除体外。SOD可有效清除体内活性氧，减轻蛋白质、膜脂、DNA及其他细胞组分的严重损伤和恢复红细胞膜的氧化损害[2-3]。SOD活性在营养、医疗、疾病、陆生动物方面都有了很多的研究，在水生动物肝胰脏等组织SOD活性和SOD在有某些因素影响下的活性研究有较多文献报道[4-8]，但水生动物血液中SOD在正常情况下的活性研究目前所见的报道和相关文献很少。
随着养殖面积和养殖密度不断增加，鱼类疾病害问题日益突出。渔药的大量使用和滥用造成了养殖水体的环境恶化，渔药残留给食品安全带来了极大的隐患[9]。目前，常规养殖中鲢已经占重要养殖地位。免疫能力的强弱与SOD活性有着密切的关系[10]。本试验测定鲢、草鱼、鲫血液中SOD活性，并加以比较，寻找其理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验用鱼
试验鲢、草鱼、鲫均购于荣昌县梅石坝渔场。试验前在水族箱内暂养2周，暂养期间的水温控制在22～24 ℃，DO 4.0～5.5 mg·L-1，增氧泵24 h不间断充氧。每天投喂鱼体总重5%的优质配合饲料（通威牌通用鱼饲料，蛋白含量为28%）1次。
1.1.2 试验药品及试剂
肝素（市售肝素冻干粉140单位/mg，1 g瓶装，每瓶140 000单位），超氧化物歧化酶测定试剂盒（购于南京建成生物工程研究所），0.9%的生理盐水（自配）。
1.1.3 主要仪器设备
解剖工具1套、注射器、加样器、高压灭菌锅、分光光度计、电子天平、离心机、水浴锅、无菌操作台等。
1.2 方法
1.2.1 生理盐水的配制
称取0.9 g氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到100 mL。
1.2.2 肝素生理盐水溶液的配制
电子天平称取0.1 g肝素冻干粉溶于100 mL生理盐水中，完全溶解后即可。
1.2.3 抗凝管的制备
先配成肝素生理盐水溶液，每管加0.1 mL横向转动离心管，使离心管管壁湿润后放置低于80 ℃烤箱中烤干备用，可抗凝2～5 mL血液。
1.2.4 血样的采集
用5 mL注射器在试验鱼的尾部抽取动脉血液2～5 mL。
1.2.5 血液的抗凝处理
把血液注入制备好的离心管中。
1.2.6 血液的离心
把所采集的血样放入离心机中离心（3 000 r·min-1，10 min）。
1.2.7 血清的提取
把离心管中的上清液用注射器抽取出来放入比色管中待用。
1.2.8 SOD活性测定
采用南京建成生物工程研究所的超氧化物歧化酶测定试剂盒测定。按说明书配好试剂和显色剂。测定时测定管和对照管平行加入（见表1）：1号试剂1.0 mL→测定管加血清8 ?L、对照管加蒸馏水8 ?L→2号试剂0.1 mL→3号试剂0.1 mL→4号试剂0.1 mL→充分混匀→置于37 ℃恒温水浴40 min→对照管和测定管中各加2 mL显色剂→混匀置于室温10 min→波长于550 nm处，1 cm光径比色杯，蒸馏水调零，比色。
按公式（1）分别计算出鲢、草鱼、鲫血液中SOD的活性。式中稀释倍数包括反映系统的稀释倍数和样本测定前的稀释倍数，本试验的稀释倍数为10。
SOD总活力（U·mL-1）=[（对照管吸光度-测定管吸光度）÷对照管吸光度]÷50%×稀释倍数 （1）
2 结果与分析
经测定得出鲢、草鱼、鲫血液中SOD的活力见表2。试验数据用SPSS13.0软件分析。从表2中能看出，三者之间的关系：血液中SOD活性鲢比草鱼高3.960（U·mL-1），差异性显著（P<0.05），草鱼比鲫低2.364（U·mL-1）性差异显著（P<0.05），鲢与鲫高1.596（U·mL-1）（P<0.05）。试验鱼之间作比较，鲢SOD活性最强，草鱼SOD活性最弱，可以说明鲢的免疫能力最强，草鱼的免疫能力最弱。
3 小结与讨论
SOD是一种起源于生命体的活性物质，是机体重要的抗氧化系统成员，作为一种特异性消除超氧化自由基的循环酶，对机体的氧化和抗氧化平衡起着至关重要的作用，此酶能消除超氧阴离子自由基（O2-），主要负责过氧化和噬菌作用造成的细胞损害的防御作用[11]。SOD作为水生生物在水环境中受到表面活性剂污染胁迫的分子毒理学指标具有一定可行性。SOD减轻脂质过氧化反应，SOD活性下降意味着自由基清除能力下降[12]。血清中活性较高的超氧化物歧化酶对维持白细胞的完整性与正常的吞噬功能具有重要意义[13]。 本试验结果鲢、草鱼、鲫血液SOD活性之间的关系从表2中可以看出：鲢血液SOD活性高于草鱼血液SOD活性（P<0.05），草鱼与鲫、鲢与鲫间血液SOD活性比较，差异显著（P<0.05）。生物SOD活性越高，说明其清除自由基的能力越强，即免疫能力越强[14]。试验鱼血液SOD活性相比较，从中比较免疫能力：鲢>鲫>草鱼。SOD是活性氧自由基（O2-）的天然消除剂，是抗氧化酶中最先与O2-酶类相结合，可作为机体非特异性免疫指标，来评判免疫刺激因子对机体非特异性免疫力的影响[15]。本试验结果显示鲢的免疫能力最强，草鱼最弱，鲫的免疫力介于与鲢与草鱼之间。SOD的活性受多种因素的影响，已有研究表明[16]。从草鱼、鲢、鲫的生活水层的pH、自身的生理条件不同来加以分析。1）3种鱼所在的生活水层不同：在养殖水体中，不同水层的pH值也不同。鲢生活在水体的中上層，其pH诱导鱼体O2-产生量与SOD对O2-的清除量处于动态平衡，细胞能进行正常的生理活动，机体处于健康状态，表明鲢的免疫能力强。长期处于低pH值的环境中，因酸度过大时，鱼体会产生大量的O2-，如果鱼体没有足够的SOD来清除过多的O2-时，就会造成细胞的损害，细胞不能进行正常的生理活动，SOD活性降低或丧失，甚至导致细胞死亡的严重后果。草鱼生活在水体的中层，笔者认为这是草鱼血液中SOD活力很低的原因之一，也是引起草鱼多病的因素。鲫生活在水体下层，水体下层pH值比中、上层高，其血液中SOD的活性比草鱼高，比鲢低，SOD的活性随水体pH值升高而增大，但到了一定的值时又会逐渐下降。鲫血液中SOD的活性应是处于随着pH值升高而下降的状态，也就是血液中SOD的活性鲫比草鱼高、比鲢低，这是笔者根据参考文献[17]来推断的。2）鱼体生理条件不同：在同一水体中，鱼体之间生理条件不同，则血液中SOD的活性也不相同。鱼体内产生的O2-量和SOD对其的清除量处于平衡之中，细胞的生理活动就能正常进行，鱼体处于健康状态。而平衡是相对的，鲢、草鱼、鲫O2-和SOD之间的平衡度不等，试验鱼间比较存在着：鲢>鲫>草鱼，即血液中SOD的活性鲢>鲫>草鱼。笔者根据本试验结果推测：养殖水体中鲢发病率相对较小，可减少治疗鱼病所用鱼药成本，同时提高鱼类食品的质量安全。
参考文献：
[1] 杨升东.超氧化物歧化酶的研究与应用[J].化学与生物工程，2004（3）：7-9.
[2] 高勇，孟宪军.CPDA液保存库血红细胞SOD和ATP酶活性的变化[J].实用医药杂志，2006（7）：837.
[3] 尹绍武，雷从改，黄海，等.点带石斑鱼不同组织同工酶的研究[J].水产科学，2006（9）：471-473.
[4] 唐学玺，张培玉.蒽对黑鱼君超氧化物歧化酶活性的影响[J].水产学报，2000（3）：217-220.
[5] 冯涛，郑微云，郭祥群，等.苯并（a）芘对大弹涂鱼肝脏超氧化物歧化酶活性的影响[J].台湾海峡，2001（2）：182-186.
[6] 雷鸣，廖柏寒，娄敏，等.LAS对澎泽鲫鳃及肝脏ATPase和SOD活性的影响[J].湖南农业大学学报（自然科学版），2004（3）：272-274.
[7] 沈盎绿，沈新强.柴油对斑马鱼超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的影响[J].海洋渔业，2005（4）：314-318
[8] 余群，郑微云，翁妍，等.石油污染对真鲷幼体中超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的毒理效应.厦门大学学报（自然科学版），1999（3）：429-434.
[9] 周维仁，刘涛，薛飞，等.氧化苦参碱对异育银鲫血液非特异性免疫因子的影响[J].江苏农业学报，2006（3）：271-275.
[10] Marcelo Mu?oz， RicardoCede?o， Jenny Rodr??guez， et al. Measurement of reactive oxygen intermediate production in haemocytes of the penaeid shrimp， Penaeus vannamei[J]. Aquaculture，2000（1-3）：89-107.
[11] 季高华，刘至治，冷向军.饲料中添加β-葡聚糖和低聚果糖对中华鳖幼鳖生长和血清SOD、溶菌酶活力的影响[J].上海水产大学学报，2004（1）：36-40.
[12] 王艳萍，祁克宗，涂健，等.内毒素对仔鸡血浆SOD活性及MDA水平的影响[J].动物医学进展，2006（5）：63-65.
[13] 王宏伟，昌艳萍，杨健，等.饲料中硒元素对中华米虾SOD活性的影响[J].河北大学学报（自然科学版），2005（5）：526-529，560.
[14] 王雷，李光友，毛远兴，等.口服免疫型药物对养殖中国对虾病害防治作用的研究[J].海洋与湖沼，1994（5）：486-492.
[15] 韩英，张辉，王琨.亚硝态氮对鲤鱼种血液SOD及GSH-Px的影响[J].淡水渔业，2007（1）：66-68.
[16] 汪开毓，耿毅，钟妮娜.鱼类应激性出血症的病理学研究[J].淡水渔业，2000（11）：28-31.
[17] 马广智，唐玫，徐军.低pH对草鱼鳃和肝组织超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响[J].中国水产科学，2001（1）：23-25.
（责任编辑：敬廷桃）
关键词 鲢;草鱼;鲫;血液;SOD活性
中图分类号：S965 文献标志码：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2021.25.002
超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）是国际公认的能够有效清除自由基的酶。在1969年被McCord和Fridovich在牛血红细胞中发现[1]，SOD是一种新型酶制剂，专一清除超氧阴离子（O2–）的关键酶。SOD在生物界分布極广，几乎从人到单细胞生物，从动物到植物，都有它的存在。SOD有多种抗氧化酶成分，能有效清除体内破坏健康、导致疾病的自由基，将其分解成对机体无害的氧分子和水分子，并顺利排除体外。SOD可有效清除体内活性氧，减轻蛋白质、膜脂、DNA及其他细胞组分的严重损伤和恢复红细胞膜的氧化损害[2-3]。SOD活性在营养、医疗、疾病、陆生动物方面都有了很多的研究，在水生动物肝胰脏等组织SOD活性和SOD在有某些因素影响下的活性研究有较多文献报道[4-8]，但水生动物血液中SOD在正常情况下的活性研究目前所见的报道和相关文献很少。
随着养殖面积和养殖密度不断增加，鱼类疾病害问题日益突出。渔药的大量使用和滥用造成了养殖水体的环境恶化，渔药残留给食品安全带来了极大的隐患[9]。目前，常规养殖中鲢已经占重要养殖地位。免疫能力的强弱与SOD活性有着密切的关系[10]。本试验测定鲢、草鱼、鲫血液中SOD活性，并加以比较，寻找其理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验用鱼
试验鲢、草鱼、鲫均购于荣昌县梅石坝渔场。试验前在水族箱内暂养2周，暂养期间的水温控制在22～24 ℃，DO 4.0～5.5 mg·L-1，增氧泵24 h不间断充氧。每天投喂鱼体总重5%的优质配合饲料（通威牌通用鱼饲料，蛋白含量为28%）1次。
1.1.2 试验药品及试剂
肝素（市售肝素冻干粉140单位/mg，1 g瓶装，每瓶140 000单位），超氧化物歧化酶测定试剂盒（购于南京建成生物工程研究所），0.9%的生理盐水（自配）。
1.1.3 主要仪器设备
解剖工具1套、注射器、加样器、高压灭菌锅、分光光度计、电子天平、离心机、水浴锅、无菌操作台等。
1.2 方法
1.2.1 生理盐水的配制
称取0.9 g氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到100 mL。
1.2.2 肝素生理盐水溶液的配制
电子天平称取0.1 g肝素冻干粉溶于100 mL生理盐水中，完全溶解后即可。
1.2.3 抗凝管的制备
先配成肝素生理盐水溶液，每管加0.1 mL横向转动离心管，使离心管管壁湿润后放置低于80 ℃烤箱中烤干备用，可抗凝2～5 mL血液。
1.2.4 血样的采集
用5 mL注射器在试验鱼的尾部抽取动脉血液2～5 mL。
1.2.5 血液的抗凝处理
把血液注入制备好的离心管中。
1.2.6 血液的离心
把所采集的血样放入离心机中离心（3 000 r·min-1，10 min）。
1.2.7 血清的提取
把离心管中的上清液用注射器抽取出来放入比色管中待用。
1.2.8 SOD活性测定
采用南京建成生物工程研究所的超氧化物歧化酶测定试剂盒测定。按说明书配好试剂和显色剂。测定时测定管和对照管平行加入（见表1）：1号试剂1.0 mL→测定管加血清8 ?L、对照管加蒸馏水8 ?L→2号试剂0.1 mL→3号试剂0.1 mL→4号试剂0.1 mL→充分混匀→置于37 ℃恒温水浴40 min→对照管和测定管中各加2 mL显色剂→混匀置于室温10 min→波长于550 nm处，1 cm光径比色杯，蒸馏水调零，比色。
按公式（1）分别计算出鲢、草鱼、鲫血液中SOD的活性。式中稀释倍数包括反映系统的稀释倍数和样本测定前的稀释倍数，本试验的稀释倍数为10。
SOD总活力（U·mL-1）=[（对照管吸光度-测定管吸光度）÷对照管吸光度]÷50%×稀释倍数 （1）
2 结果与分析
经测定得出鲢、草鱼、鲫血液中SOD的活力见表2。试验数据用SPSS13.0软件分析。从表2中能看出，三者之间的关系：血液中SOD活性鲢比草鱼高3.960（U·mL-1），差异性显著（P<0.05），草鱼比鲫低2.364（U·mL-1）性差异显著（P<0.05），鲢与鲫高1.596（U·mL-1）（P<0.05）。试验鱼之间作比较，鲢SOD活性最强，草鱼SOD活性最弱，可以说明鲢的免疫能力最强，草鱼的免疫能力最弱。
3 小结与讨论
SOD是一种起源于生命体的活性物质，是机体重要的抗氧化系统成员，作为一种特异性消除超氧化自由基的循环酶，对机体的氧化和抗氧化平衡起着至关重要的作用，此酶能消除超氧阴离子自由基（O2-），主要负责过氧化和噬菌作用造成的细胞损害的防御作用[11]。SOD作为水生生物在水环境中受到表面活性剂污染胁迫的分子毒理学指标具有一定可行性。SOD减轻脂质过氧化反应，SOD活性下降意味着自由基清除能力下降[12]。血清中活性较高的超氧化物歧化酶对维持白细胞的完整性与正常的吞噬功能具有重要意义[13]。 本试验结果鲢、草鱼、鲫血液SOD活性之间的关系从表2中可以看出：鲢血液SOD活性高于草鱼血液SOD活性（P<0.05），草鱼与鲫、鲢与鲫间血液SOD活性比较，差异显著（P<0.05）。生物SOD活性越高，说明其清除自由基的能力越强，即免疫能力越强[14]。试验鱼血液SOD活性相比较，从中比较免疫能力：鲢>鲫>草鱼。SOD是活性氧自由基（O2-）的天然消除剂，是抗氧化酶中最先与O2-酶类相结合，可作为机体非特异性免疫指标，来评判免疫刺激因子对机体非特异性免疫力的影响[15]。本试验结果显示鲢的免疫能力最强，草鱼最弱，鲫的免疫力介于与鲢与草鱼之间。SOD的活性受多种因素的影响，已有研究表明[16]。从草鱼、鲢、鲫的生活水层的pH、自身的生理条件不同来加以分析。1）3种鱼所在的生活水层不同：在养殖水体中，不同水层的pH值也不同。鲢生活在水体的中上層，其pH诱导鱼体O2-产生量与SOD对O2-的清除量处于动态平衡，细胞能进行正常的生理活动，机体处于健康状态，表明鲢的免疫能力强。长期处于低pH值的环境中，因酸度过大时，鱼体会产生大量的O2-，如果鱼体没有足够的SOD来清除过多的O2-时，就会造成细胞的损害，细胞不能进行正常的生理活动，SOD活性降低或丧失，甚至导致细胞死亡的严重后果。草鱼生活在水体的中层，笔者认为这是草鱼血液中SOD活力很低的原因之一，也是引起草鱼多病的因素。鲫生活在水体下层，水体下层pH值比中、上层高，其血液中SOD的活性比草鱼高，比鲢低，SOD的活性随水体pH值升高而增大，但到了一定的值时又会逐渐下降。鲫血液中SOD的活性应是处于随着pH值升高而下降的状态，也就是血液中SOD的活性鲫比草鱼高、比鲢低，这是笔者根据参考文献[17]来推断的。2）鱼体生理条件不同：在同一水体中，鱼体之间生理条件不同，则血液中SOD的活性也不相同。鱼体内产生的O2-量和SOD对其的清除量处于平衡之中，细胞的生理活动就能正常进行，鱼体处于健康状态。而平衡是相对的，鲢、草鱼、鲫O2-和SOD之间的平衡度不等，试验鱼间比较存在着：鲢>鲫>草鱼，即血液中SOD的活性鲢>鲫>草鱼。笔者根据本试验结果推测：养殖水体中鲢发病率相对较小，可减少治疗鱼病所用鱼药成本，同时提高鱼类食品的质量安全。
参考文献：
[1] 杨升东.超氧化物歧化酶的研究与应用[J].化学与生物工程，2004（3）：7-9.
[2] 高勇，孟宪军.CPDA液保存库血红细胞SOD和ATP酶活性的变化[J].实用医药杂志，2006（7）：837.
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[6] 雷鸣，廖柏寒，娄敏，等.LAS对澎泽鲫鳃及肝脏ATPase和SOD活性的影响[J].湖南农业大学学报（自然科学版），2004（3）：272-274.
[7] 沈盎绿，沈新强.柴油对斑马鱼超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的影响[J].海洋渔业，2005（4）：314-318
[8] 余群，郑微云，翁妍，等.石油污染对真鲷幼体中超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的毒理效应.厦门大学学报（自然科学版），1999（3）：429-434.
[9] 周维仁，刘涛，薛飞，等.氧化苦参碱对异育银鲫血液非特异性免疫因子的影响[J].江苏农业学报，2006（3）：271-275.
[10] Marcelo Mu?oz， RicardoCede?o， Jenny Rodr??guez， et al. Measurement of reactive oxygen intermediate production in haemocytes of the penaeid shrimp， Penaeus vannamei[J]. Aquaculture，2000（1-3）：89-107.
[11] 季高华，刘至治，冷向军.饲料中添加β-葡聚糖和低聚果糖对中华鳖幼鳖生长和血清SOD、溶菌酶活力的影响[J].上海水产大学学报，2004（1）：36-40.
[12] 王艳萍，祁克宗，涂健，等.内毒素对仔鸡血浆SOD活性及MDA水平的影响[J].动物医学进展，2006（5）：63-65.
[13] 王宏伟，昌艳萍，杨健，等.饲料中硒元素对中华米虾SOD活性的影响[J].河北大学学报（自然科学版），2005（5）：526-529，560.
[14] 王雷，李光友，毛远兴，等.口服免疫型药物对养殖中国对虾病害防治作用的研究[J].海洋与湖沼，1994（5）：486-492.
[15] 韩英，张辉，王琨.亚硝态氮对鲤鱼种血液SOD及GSH-Px的影响[J].淡水渔业，2007（1）：66-68.
[16] 汪开毓，耿毅，钟妮娜.鱼类应激性出血症的病理学研究[J].淡水渔业，2000（11）：28-31.
[17] 马广智，唐玫，徐军.低pH对草鱼鳃和肝组织超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响[J].中国水产科学，2001（1）：23-25.
（责任编辑：敬廷桃）