以采自连翘主产区河南和山西12个产地的77份连翘种质资源为试材,采用EST-SSR分子标记技术分析其遗传多样性,以期探索不同产地连翘的遗传相似性以及其关键影响因素。结果表明:从60对引物中筛选出14对扩增条带清晰,稳定性好的多态性EST-SSR引物,14对引物在77份样品中共扩增出370条带,多态性条带368条,多态位点百分率为99.46%,12个产地的遗传距离范围是0.020 3～0.092 2,平均遗传距离为0.055 8。根据遗传相似系数对12个产地进行聚类分析,在0.935处把12个居群聚为5类;同时对77份样品进行聚类分析,在0.72处把77份样品聚为5类,个体聚类结果与产地聚类结果相似。聚类结果分析表明,连翘的遗传相似性与地理距离没有显著的相关性,主要与生长环境以及海拔等因素有关。试验结果揭示了不同产地连翘遗传相似度的关键因素,为连翘亲缘关系的鉴定、连翘资源的保护与开发奠定了基础。