【摘 要】
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目的 构建带绿色荧光蛋白报告载体(pEGFP-C1)的死骨片1(SQSTM1/P62)真核表达载体,在获得pEGFP-SQSTM1融合表达蛋白后,对其功能进行验证.方法 以人乳腺文库为模板,通过聚合酶
【机 构】
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军事科学院军事医学研究院生物工程研究所细胞工程研究室,北京 100850;解放军252医院,河北保定 071000;首都医科大学宣武医院呼吸科,北京,100053;军事科学院军事医学研究院生物工程研究
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目的 构建带绿色荧光蛋白报告载体(pEGFP-C1)的死骨片1(SQSTM1/P62)真核表达载体,在获得pEGFP-SQSTM1融合表达蛋白后,对其功能进行验证.方法 以人乳腺文库为模板,通过聚合酶链反应(PCR)扩增人SQSTM1基因编码序列,插入到pEGFP-C1载体中,把测序正确的重组质粒转染人胚肾293T细胞,蛋白质印迹法(Western blotting)检测该融合蛋白表达情况;分别转染pEGFP-C1空载体、pEGFP-SQSTM1至乳腺癌细胞ZR75-1,荧光显微镜观察SQSTM1蛋白在细胞中的定位情况;荧光漂白后恢复实验(FRAP)验证乳腺癌细胞ZR75-1中SQSTM1小体荧光漂白后恢复情况.结果 重组质粒pEGFP-SQSTM1的基因序列与目的序列完全一致,Western印迹检测蛋白表达成功;荧光显微镜观察SQSTM1的表达,结果显示,表达产物主要以点状小体形式定位于乳腺癌ZR75-1细胞的胞质中;FRAP实验验证乳腺癌细胞ZR75-1中SQSTM1小体激光漂白后绿色荧光可恢复.结论 成功构建pEGFP-SQSTM1真核表达载体,证实了SQSTM1蛋白在人乳腺癌细胞ZR75-1中表达,表达蛋白以点状小体形式定位于细胞质中,为进一步研究SQSTM1小体的功能提供基础.
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