【摘 要】
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[目的] 采用生物信息学研究方法,筛选分析果生刺盘孢效应子,并验证其功能,为其致病相关基因研究提供理论依据,同时为油茶病害管理提供参考.[方法] 对果生刺盘孢非侵染期(分生孢子)和侵染时期(油茶叶片病斑组织)进行 RNA-seq 测序,并利用生物信息分析软件 BUSCA、Target P、big-PI Predictor 和 GO、KEGG、PHI数据库分析转录组数据,选出符合条件的候选效应子,再利用 qRT-PCR 技术对效应子进行相对定量分析; 克隆候选效应子全长基因,通过烟草瞬时表达系统和 DAB染
【机 构】
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中南林业科技大学 南方人工林病虫害防治国家林业局重点实验室 森林有害生物防控湖南省重点实验室经济林培育与保护教育部重点实验室 长沙 410004
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[目的] 采用生物信息学研究方法,筛选分析果生刺盘孢效应子,并验证其功能,为其致病相关基因研究提供理论依据,同时为油茶病害管理提供参考.[方法] 对果生刺盘孢非侵染期(分生孢子)和侵染时期(油茶叶片病斑组织)进行 RNA-seq 测序,并利用生物信息分析软件 BUSCA、Target P、big-PI Predictor 和 GO、KEGG、PHI数据库分析转录组数据,选出符合条件的候选效应子,再利用 qRT-PCR 技术对效应子进行相对定量分析; 克隆候选效应子全长基因,通过烟草瞬时表达系统和 DAB染色验证相应基因功能.[结果] 1) 转录组结果数据显示,侵染时期相对于非侵染时期有7 850个差异表达基因.对差异表达基因的编码蛋白进行预测分析,345个为经典分泌蛋白,占总数的4. 39%.经典分泌蛋白氨基酸长度在各区间段分布较为均匀,而符合效应子筛选条件(＜300 aa)的蛋白约占经典分泌蛋白总数的 36% ,数量相对较少.信号肽长度集中在 18～20 aa(占 48. 7% ) ,信号肽切割位点以 SPase I型为主(占 88. 41% ) . KEGG功能富集分析得到 164条 Pathway信息,多为真菌代谢途径、次生代谢产物、淀粉和蔗糖代谢相关的通路. PHI致病菌数据库同源比对结果表明,在经典分泌蛋白中含有 80 条与真菌致病力相关的基因,其中包括 1个已知效应子.以氨基酸长度＜300 和半胱氨酸残基数≥4 为筛选条件,并过滤已经注释过功能的蛋白后,在果生刺盘孢中筛选出 17个候选效应子. 2) 随机抽样选取 9 个候选效应子做 qRT-PCR分析,结果显示 9个基因均为上调表达,与转录组数据结果相符. 3)克隆出 4 个候选效应子,并通过烟草瞬时表达系统和 DAB染色,验证出 4个候选效应子均能引起植物细胞坏死.[结论] 果生刺盘孢在侵染油茶时期有多个效应子表达,而在分生孢子时期此类蛋白多为不表达或少量表达,这验证了效应子是植物与病原菌相互作用的关键因素.
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