【摘 要】
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目的:构建及表达抗人CD33单链抗体(抗CD33-scFv)基因,并检测其生物活性.方法:采用RT-PCR方法从分泌抗人类白细胞表面分化抗原CD33单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞中克隆出VL和VH
【机 构】
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中国医学科学院,北京协和医学院(清华大学医学部)血液学研究所,血液病医院免疫室,天津,300020
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目的:构建及表达抗人CD33单链抗体(抗CD33-scFv)基因,并检测其生物活性.方法:采用RT-PCR方法从分泌抗人类白细胞表面分化抗原CD33单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞中克隆出VL和VH可变区基因,再通过重叠延伸拼接(splice-overlap extension)PCR方法在VH和VL可变区基因之间引入柔性连接肽(Gly4Ser)3,体外构建抗人CD33-scFv基因.将其克隆至原核表达载体PET-28a(+)并在大肠杆菌Rosetta(DE3)中表达.结果:SDS-PAGE和Westem blot分析结果表明,抗CD33-scFv在Rosetta(DE3)菌中获得高效表达,重组蛋白的相对分子质量(Mr)为30000,表达产物以不溶性包涵体形式存在,经过溶解包涵体,镍柱亲和层析纯化和体外复性过程,获得了高纯度的scFv片段.流式细胞术(FCM)分析结果证实抗CD33-scFv可与人类白细胞表面的分化抗原CD33结合,保留了鼠源性mAb的与CD33结合的活性.结论:重组抗人CD33-scFv基因构建与表达成功,并且通过复性得到有生物活性的scFv,为下一步针对髓系恶性肿瘤的靶向治疗奠定了基础.
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