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摘要
烤烟主栽品种‘K326’在打顶后，随着次生代谢产物的积累，烟草花叶病症状呈减轻趋势。本试验利用半叶枯斑法对‘K326’的全株、根、茎、叶甲醇提取物及根部不同极性溶剂萃取物进行抗烟草普通花叶病毒活性筛选，结果表明：在浓度为1 mg/mL时，‘K326’各部位甲醇提取物中，根部甲醇提取物的活性最强，对TMV体外钝化、初侵染和复制增殖作用的抑制率分别为74.50%、68.82%和47.76%；利用不同极性溶剂对根部甲醇提取物萃取处理后，乙酸乙酯萃取物活性增强明显，对TMV体外钝化、初侵染和复制增殖作用的抑制率分别为76.81%、78.02%、61.42%；经普通烟‘K326’进一步验证，根部甲醇提取物的乙酸乙酯萃取物活性最强。综上，‘K326’中抗病毒防御物质可能存在于根部甲醇提取物的乙酸乙酯萃取物中。
关键词
烤烟提取物；烟草花叶病毒（TMV）；抑制活性
中图分类号：
S 435.72
文献标识码：A
DOI：10.3969/j.issn.05291542.2017.05.017
AntiTMV activity of the extracts from tobacco ‘K326’
Zhou Wenbing1，2，Ji Sigui1，Li Jiangzhou1，2，Cui Yonghe1，2，Huang Zhihua1，2，Zhang Limeng1，2
（1. Yunnan Tobacco Company， Yuxi Branch， Yuxi653100， China； 2. Research Center for Application Technology of
Biological Control Engineering for Tobacco Diseases and Insect Pests of China Tobacco，Yuxi653100， China）
Abstract
The antiviral activity of the extract from ‘K326’ against Tobacco mosaic virus （TMV） was determined by a halfleaf necrosis method. The methanol extracts from different parts of ‘K326’ showed good inhibitory activities against TMV at 1 mg/mL. Especially the methanol extracts from roots exhibited the best inhibitory activities on TMV inactivation， primary infection， and proliferation with an inhibition rate of 74.50%， 68.82% and 47.76%， respectively； the methanol extracts from roots were disposed with different organic solutions， i.e.， petroleum ether， ethyl acetate and nbutanol； after that， the antiviral activity of the extracts with ethyl acetate increased significantly， with an inhibition rate of 76.81%， 78.02% and 61.42%， respectively. Further experiments on ‘K326’ suggested that the antiviral activity of the extracts of ethyl acetate was the best.
Key words
extraction from tobacco；Tobacco mosaic virus （TMV）；inhibitory activity
煙草花叶病毒Tobacco mosaic virus， （TMV）作为世界上最先发现并确定的病毒，严重危害烟叶的产量和质量，给烟农造成了巨大的经济损失[13]。由于植物病毒对寄主细胞具有绝对寄生性，病毒传播方式具有多样性，且植物缺乏完整的免疫系统，因而高效抗病毒剂的开发存在极大困难，至今尚未有理想的防治药剂[4]。目前采用的农业防治措施存在较大的局限性，化学防治则易引发环保问题，于是人们把目光转向了抗TMV 天然产物的研究与开发[57]。
‘K326’是我国主栽烤烟品种，烟草花叶病是该品种的主要病害之一，经多年观察，我们发现烤烟‘K326’在打顶后，随着次生代谢产物的积累，烟草花叶病症状呈明显减轻趋势。因此，有必要对‘K326’中烟草花叶病的抗性物质进行系统研究，为‘K326’高感花叶病寻求一条新的解决途径的同时，也可以进一步拓宽烟草的使用空间。
本研究从烟草内源性抗烟草花叶病次生代谢物质出发，利用半叶枯斑法对‘K326’的全株、根、茎、叶甲醇提取物及根部不同极性萃取物进行抗烟草花叶病毒活性筛选，并用圆盘悬浮筛选法对筛选结果进行验证，为‘K326’中抗烟草花叶病的物质基础研究提供依据。
1材料与方法
1.1烟草的培育
以心叶烟 Nicotiana glutinosa L.和普通烟Nicotiana tabacum L. ‘K326’为供试烤烟品种，烟草种子由玉溪中烟种子有限责任公司提供。将烟草种子播种于装有基质的育苗盘，漂于育苗池中，于适宜条件下（温度22±1℃，光照16 h/d，湿度60%） 培养，待幼苗长至三叶期移植于小花盆中， 每盆1株。试验用苗均放置于（23±1）℃人工气候箱中，光照和黑暗循环为12 h∥12 h，待长至4～6片真叶时供试[8]。 1.2供试烟草样品
‘K326’样品由云南省烟草公司玉溪市公司烤烟生产技术中心提供，全株、根、茎和叶在烤烟打顶30 d后采收，样品分别剁碎，50℃烘干，粉碎，过40目筛，室温保存备用。
1.3供试病毒
烟草花叶病毒Tobacco mosaic virus（TMV）普通株系，由云南省烟草农业科学研究院提供，由本实验室保存于普通烟 ‘K326’上。保存毒源的烟草用纱网罩严，并单独放置在25℃恒温温室中培养，温室光照条件为L∥D=16 h∥8 h。培养过程中注意防虫，严防其他病毒及病害对毒源的污染[9]。在开展抗病毒活性测定的当天按照下述方法提取 TMV 的粗提液，最大限度保证 TMV 活性。TMV 粗提液提取方法：选取幼嫩、新鲜的病叶 100 g，放置在研钵中，加入200 mL的0.1 mol/L磷酸缓冲液（PBS， pH=7.2，内含1%的巯基乙醇），研磨过滤，取滤液并加入8%正丁醇，搅拌15 min，4℃、10 000 g离心30 min，取上清液，沉淀加入聚乙二醇3000（PEG3000）至终浓度4%，同时加NaCl至终浓度为3%，4℃放置1 h，4℃、10 000 g离心15 min，弃上清，沉淀溶于20 mL 0.01 mol/L PBS （pH=7.2） 缓冲液中，室温搅拌2 h，4℃、10 000 g离心15 min，取上清，按每10 mL加入0.4 g的NaCl及0.4 g的PEG3000，边加边搅拌使其完全溶解，搅拌1 h，4℃、10 000 g离心30 min，取沉淀，按照原液每100 mL加入2 mL 0.01 mol/L PBS （pH=7.2），待沉淀完全溶解后，4℃ 10 000 g离心30 min。上清液即为TMV粗提液，保存到4℃冰箱备用[10]。病毒浓度用鲜叶质量（mg）与缓冲液的体积（L）比来定义，心叶烟接种浓度为20 mg/L，普通烟 ‘K326’接种浓度为50 mg/L。
1.4样品的制备
每样称取样品粉末100 g，置1 L的三角烧瓶中，每次加入500 mL分析纯甲醇，室温下超声提取3次，每次15 min，合并3次滤液，浓缩得粗提物[11]。待粗提物回收无醇味，加入少量纯净水使样品混溶倒入分液漏斗，分别加入等体积石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，每溶剂萃取5次，回收各萃取液得各极性段样品，剩余水层回收得水提取物。称取少量提取物（约100 mg），用少量二甲亚砜（DMSO）溶解后加水配成100 mg/mL的水溶液，按比例分别加水稀释成10、1和0.1 mg/mL的水溶液，置于4℃冰箱备用[1213]。对照药剂为宁南霉素8%水剂按质量浓度配制成相应浓度的水溶液，宁南霉素8%水剂由上海丰农生物科技有限公司提供。
1.5试验方法
1.5.1对TMV体外钝化作用测定
采用半叶枯斑法[14]测定。选取生长旺盛的4～6叶期心叶烟，将浓度为1 mg/mL的‘K326’各提取物溶液和对应剂量的溶剂分别与等体积的TMV溶液混合钝化30 min，然后分别摩擦接种于心叶烟左半叶和右半叶。待叶片干后用清水将叶片冲洗干净。随后在光照培养箱中保温保湿培养，温度（22±1）℃，光照12 h/d，湿度60%，3～4 d后观察并记录枯斑的数目。每处理3株，每株3～4片叶；每处理重复3次。
1.5.2各提取物对TMV初侵染和复制增殖抑制作用测定
采用半叶枯斑法[14]测定。选取生长旺盛的4～6叶期心叶烟，初侵染试验在左半叶涂施一定浓度的粗提物溶液，右半叶涂对应剂量的溶剂作对照。间隔12 h后再摩擦法全叶接种病毒；复制增殖作用先全叶摩擦接种病毒，待叶片干后12 h，左半叶涂施提取物溶液，右半叶涂施对应剂量的溶剂作对照。随后在光照培养箱中保温保湿培养，温度（22±1）℃，光照12 h/d，湿度60%，3～4 d后观察并分别记录左右半叶枯斑的数目。每处理3株，每株3～4片叶；每处理重复3次。
1.5.3各提取物对TMV在‘K326’体内增殖抑制活性测定
采用叶圆片悬浮筛选法[1516]进行测定。用摩擦法接种TMV于‘K326’叶片，6 h后用清水冲洗叶片，2 h后（叶片淋洗水变干），用打孔器在接种叶片上切取直径12 mm的圆盘。将接种面朝上，让其漂浮在含不同浓度供试液的培养皿中，3 d后磨碎叶片，用间接ELISA法检测病毒含量，并分别设药剂空白接种病毒和不接种病毒的阳性和阴性叶片为对照。每处理6个圆盘。
1.5.4结果计算与统计方法
（1）枯斑抑制率计算公式如下：
供试化合物对烟草花叶病的抑制率（%）计算公式为：抑制率（%）=[（对照枯斑数-处理枯斑数）/对照枯斑数]×100。
（2）病毒增殖抑制率计算公式如下：
病毒增殖抑制率（%）=[（药剂空白阳性叶片对照病毒含量-药剂处理叶片病毒含量）/ 药剂空白阳性叶片对照病毒含量]×100。
2结果与分析
2.1‘K326’提取物对TMV侵染活性的抑制作用
2.1.1体外钝化作用
從表1可见：用‘K326’各部位提取物溶液对病毒提取液钝化处理后接种烟叶，‘K326’全株及根、茎、叶的甲醇提取物对TMV均表现出一定钝化作用；根、茎部甲醇提取物活性高于全株提取物，抑制率分别为74.50%和37.56%；对根部甲醇提取物用不同极性溶剂萃取后，较根部甲醇提取物，乙酸乙酯萃取物活性稍有增强，对TMV侵染的抑制率达到76.81%，其他极性溶剂萃取物活性降低。
1） 数字上标表示显著性分析组别，不同字母表示组内差异显著（P<0.05）；下同。
Numeric superscript indicates the groups and different lowercase letters indicates significant difference （P<0.05）； the same below. 2.1.2保护作用
从表2可见：在TMV侵染过程中，‘K326’各部位的甲醇提取物对TMV寄主均表现出一定的保护作用，根和茎的甲醇提取物活性高于全株甲醇提取物，对TMV侵染抑制率分别达到68.82%和59.46%；对根部甲醇提取物用不同极性溶剂萃取后，较根部甲醇提取物，乙酸乙酯萃取物活性增强明显，对TMV寄主的保护作用达到78.02%。
2.1.3治疗作用
从表3可见：TMV侵染初期，除烟叶的甲醇提取物外，‘K326’各部位甲醇提取物对TMV侵染均表现出一定的治疗作用，根和茎的甲醇提取物活性高于全株提取物，对TMV侵染的抑制率分别为47.76%和42.40%；对根部甲醇提取物用不同极性溶剂萃取后，较根部甲醇提取物，乙酸乙酯和石油醚萃取物对TMV侵染的治疗作用明显增强，抑制率分别为61.42%和53.78%。
2.2根部提取物对TMV增殖的抑制活性
为了进一步验证‘K326’根部提取物对TMV的抑制活性，我们在普通烟‘K326’上采用圆盘悬浮筛选法对‘K326’根部甲醇提取物、乙酸乙酯、石油醚萃取物对TMV增殖的抑制活性进行测定。从图1可见：通过0.1、1、10 mg/mL 3个浓度的筛选发现，随着样品浓度的提高，3个提取物对TMV增殖的抑制率逐渐提高，表现出显著的剂量效应；3种浓度下，均以乙酸乙酯萃取物活性最强，石油醚萃取物活性最弱。
3讨论
烟草中的化学成分极为复杂，近几十年来，国内外研究者对烟草进行了大量研究，从中发现并鉴定的化学成分已有2 549种。同时，学者也从烟草中发现了具有抗病毒作用的活性物质，Cotelle等发现，烟草中酚类化合物对清除自由基作用良好，并且富含抗氧化活性[1718]。流行病学研究表明，抗氧化化合物一般都具有一定的抗病毒活性[1920]。Ohnishi等也发现烟草中含量较高的绿原酸的水解产物咖啡酸具有抑制单纯疱疹病毒的功效[21]。德国Free大学Eich教授在研究植物次生代谢物作为抗逆转录病毒剂时，发现绿原酸及其衍生物具有较好的抗艾滋病毒（HIV）活性[2122]。
以上研究主要是烟草中活性物质在抗人类疾病中的应用，但对其在对抗自然界逆境而形成的抵御病害的化学防御物质却涉猎较少。本研究基于烟草种植过程中发现的自然现象，首次从化学防御角度对‘K326’在对抗TMV侵袭过程中产生的防御物质进行了初步研究。发现‘K326’的全株、根、茎和叶的甲醇提取物对TMV体外钝化、初侵染和复制增殖均具有一定的抑制活性，根的甲醇提取物活性最强；对根部甲醇提取物用不同极性溶剂萃取后，较根部甲醇提取物，乙酸乙酯萃取物活性增强明显，石油醚、水和正丁醇萃取物活性均不同程度降低；经对根部甲醇提取物、乙酸乙酯、石油醚萃取物活性进一步验证，3个提取物均表现出明显的剂量效应，乙酸乙酯萃取物活性最强。以上结果表明，‘K326’中抗TMV 化学防御物质可能存在于根部甲醇提取物的乙酸乙酯萃取物中，在今后的研究中我们将对根部甲醇提取物的乙酸乙酯萃取物进行跟踪提取分离鉴定，对其抗TMV 化学防御物质进一步研究发掘。
参考文献
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[22]周恒，许自成，赵会纳，等. 烟草多酚类物质的研究进展[J]. 浙江农业科学，2009（5）： 949953.
（责任编辑：田喆）
烤烟主栽品种‘K326’在打顶后，随着次生代谢产物的积累，烟草花叶病症状呈减轻趋势。本试验利用半叶枯斑法对‘K326’的全株、根、茎、叶甲醇提取物及根部不同极性溶剂萃取物进行抗烟草普通花叶病毒活性筛选，结果表明：在浓度为1 mg/mL时，‘K326’各部位甲醇提取物中，根部甲醇提取物的活性最强，对TMV体外钝化、初侵染和复制增殖作用的抑制率分别为74.50%、68.82%和47.76%；利用不同极性溶剂对根部甲醇提取物萃取处理后，乙酸乙酯萃取物活性增强明显，对TMV体外钝化、初侵染和复制增殖作用的抑制率分别为76.81%、78.02%、61.42%；经普通烟‘K326’进一步验证，根部甲醇提取物的乙酸乙酯萃取物活性最强。综上，‘K326’中抗病毒防御物质可能存在于根部甲醇提取物的乙酸乙酯萃取物中。
关键词
烤烟提取物；烟草花叶病毒（TMV）；抑制活性
中图分类号：
S 435.72
文献标识码：A
DOI：10.3969/j.issn.05291542.2017.05.017
AntiTMV activity of the extracts from tobacco ‘K326’
Zhou Wenbing1，2，Ji Sigui1，Li Jiangzhou1，2，Cui Yonghe1，2，Huang Zhihua1，2，Zhang Limeng1，2
（1. Yunnan Tobacco Company， Yuxi Branch， Yuxi653100， China； 2. Research Center for Application Technology of
Biological Control Engineering for Tobacco Diseases and Insect Pests of China Tobacco，Yuxi653100， China）
Abstract
The antiviral activity of the extract from ‘K326’ against Tobacco mosaic virus （TMV） was determined by a halfleaf necrosis method. The methanol extracts from different parts of ‘K326’ showed good inhibitory activities against TMV at 1 mg/mL. Especially the methanol extracts from roots exhibited the best inhibitory activities on TMV inactivation， primary infection， and proliferation with an inhibition rate of 74.50%， 68.82% and 47.76%， respectively； the methanol extracts from roots were disposed with different organic solutions， i.e.， petroleum ether， ethyl acetate and nbutanol； after that， the antiviral activity of the extracts with ethyl acetate increased significantly， with an inhibition rate of 76.81%， 78.02% and 61.42%， respectively. Further experiments on ‘K326’ suggested that the antiviral activity of the extracts of ethyl acetate was the best.
Key words
extraction from tobacco；Tobacco mosaic virus （TMV）；inhibitory activity
煙草花叶病毒Tobacco mosaic virus， （TMV）作为世界上最先发现并确定的病毒，严重危害烟叶的产量和质量，给烟农造成了巨大的经济损失[13]。由于植物病毒对寄主细胞具有绝对寄生性，病毒传播方式具有多样性，且植物缺乏完整的免疫系统，因而高效抗病毒剂的开发存在极大困难，至今尚未有理想的防治药剂[4]。目前采用的农业防治措施存在较大的局限性，化学防治则易引发环保问题，于是人们把目光转向了抗TMV 天然产物的研究与开发[57]。
‘K326’是我国主栽烤烟品种，烟草花叶病是该品种的主要病害之一，经多年观察，我们发现烤烟‘K326’在打顶后，随着次生代谢产物的积累，烟草花叶病症状呈明显减轻趋势。因此，有必要对‘K326’中烟草花叶病的抗性物质进行系统研究，为‘K326’高感花叶病寻求一条新的解决途径的同时，也可以进一步拓宽烟草的使用空间。
本研究从烟草内源性抗烟草花叶病次生代谢物质出发，利用半叶枯斑法对‘K326’的全株、根、茎、叶甲醇提取物及根部不同极性萃取物进行抗烟草花叶病毒活性筛选，并用圆盘悬浮筛选法对筛选结果进行验证，为‘K326’中抗烟草花叶病的物质基础研究提供依据。
1材料与方法
1.1烟草的培育
以心叶烟 Nicotiana glutinosa L.和普通烟Nicotiana tabacum L. ‘K326’为供试烤烟品种，烟草种子由玉溪中烟种子有限责任公司提供。将烟草种子播种于装有基质的育苗盘，漂于育苗池中，于适宜条件下（温度22±1℃，光照16 h/d，湿度60%） 培养，待幼苗长至三叶期移植于小花盆中， 每盆1株。试验用苗均放置于（23±1）℃人工气候箱中，光照和黑暗循环为12 h∥12 h，待长至4～6片真叶时供试[8]。 1.2供试烟草样品
‘K326’样品由云南省烟草公司玉溪市公司烤烟生产技术中心提供，全株、根、茎和叶在烤烟打顶30 d后采收，样品分别剁碎，50℃烘干，粉碎，过40目筛，室温保存备用。
1.3供试病毒
烟草花叶病毒Tobacco mosaic virus（TMV）普通株系，由云南省烟草农业科学研究院提供，由本实验室保存于普通烟 ‘K326’上。保存毒源的烟草用纱网罩严，并单独放置在25℃恒温温室中培养，温室光照条件为L∥D=16 h∥8 h。培养过程中注意防虫，严防其他病毒及病害对毒源的污染[9]。在开展抗病毒活性测定的当天按照下述方法提取 TMV 的粗提液，最大限度保证 TMV 活性。TMV 粗提液提取方法：选取幼嫩、新鲜的病叶 100 g，放置在研钵中，加入200 mL的0.1 mol/L磷酸缓冲液（PBS， pH=7.2，内含1%的巯基乙醇），研磨过滤，取滤液并加入8%正丁醇，搅拌15 min，4℃、10 000 g离心30 min，取上清液，沉淀加入聚乙二醇3000（PEG3000）至终浓度4%，同时加NaCl至终浓度为3%，4℃放置1 h，4℃、10 000 g离心15 min，弃上清，沉淀溶于20 mL 0.01 mol/L PBS （pH=7.2） 缓冲液中，室温搅拌2 h，4℃、10 000 g离心15 min，取上清，按每10 mL加入0.4 g的NaCl及0.4 g的PEG3000，边加边搅拌使其完全溶解，搅拌1 h，4℃、10 000 g离心30 min，取沉淀，按照原液每100 mL加入2 mL 0.01 mol/L PBS （pH=7.2），待沉淀完全溶解后，4℃ 10 000 g离心30 min。上清液即为TMV粗提液，保存到4℃冰箱备用[10]。病毒浓度用鲜叶质量（mg）与缓冲液的体积（L）比来定义，心叶烟接种浓度为20 mg/L，普通烟 ‘K326’接种浓度为50 mg/L。
1.4样品的制备
每样称取样品粉末100 g，置1 L的三角烧瓶中，每次加入500 mL分析纯甲醇，室温下超声提取3次，每次15 min，合并3次滤液，浓缩得粗提物[11]。待粗提物回收无醇味，加入少量纯净水使样品混溶倒入分液漏斗，分别加入等体积石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，每溶剂萃取5次，回收各萃取液得各极性段样品，剩余水层回收得水提取物。称取少量提取物（约100 mg），用少量二甲亚砜（DMSO）溶解后加水配成100 mg/mL的水溶液，按比例分别加水稀释成10、1和0.1 mg/mL的水溶液，置于4℃冰箱备用[1213]。对照药剂为宁南霉素8%水剂按质量浓度配制成相应浓度的水溶液，宁南霉素8%水剂由上海丰农生物科技有限公司提供。
1.5试验方法
1.5.1对TMV体外钝化作用测定
采用半叶枯斑法[14]测定。选取生长旺盛的4～6叶期心叶烟，将浓度为1 mg/mL的‘K326’各提取物溶液和对应剂量的溶剂分别与等体积的TMV溶液混合钝化30 min，然后分别摩擦接种于心叶烟左半叶和右半叶。待叶片干后用清水将叶片冲洗干净。随后在光照培养箱中保温保湿培养，温度（22±1）℃，光照12 h/d，湿度60%，3～4 d后观察并记录枯斑的数目。每处理3株，每株3～4片叶；每处理重复3次。
1.5.2各提取物对TMV初侵染和复制增殖抑制作用测定
采用半叶枯斑法[14]测定。选取生长旺盛的4～6叶期心叶烟，初侵染试验在左半叶涂施一定浓度的粗提物溶液，右半叶涂对应剂量的溶剂作对照。间隔12 h后再摩擦法全叶接种病毒；复制增殖作用先全叶摩擦接种病毒，待叶片干后12 h，左半叶涂施提取物溶液，右半叶涂施对应剂量的溶剂作对照。随后在光照培养箱中保温保湿培养，温度（22±1）℃，光照12 h/d，湿度60%，3～4 d后观察并分别记录左右半叶枯斑的数目。每处理3株，每株3～4片叶；每处理重复3次。
1.5.3各提取物对TMV在‘K326’体内增殖抑制活性测定
采用叶圆片悬浮筛选法[1516]进行测定。用摩擦法接种TMV于‘K326’叶片，6 h后用清水冲洗叶片，2 h后（叶片淋洗水变干），用打孔器在接种叶片上切取直径12 mm的圆盘。将接种面朝上，让其漂浮在含不同浓度供试液的培养皿中，3 d后磨碎叶片，用间接ELISA法检测病毒含量，并分别设药剂空白接种病毒和不接种病毒的阳性和阴性叶片为对照。每处理6个圆盘。
1.5.4结果计算与统计方法
（1）枯斑抑制率计算公式如下：
供试化合物对烟草花叶病的抑制率（%）计算公式为：抑制率（%）=[（对照枯斑数-处理枯斑数）/对照枯斑数]×100。
（2）病毒增殖抑制率计算公式如下：
病毒增殖抑制率（%）=[（药剂空白阳性叶片对照病毒含量-药剂处理叶片病毒含量）/ 药剂空白阳性叶片对照病毒含量]×100。
2结果与分析
2.1‘K326’提取物对TMV侵染活性的抑制作用
2.1.1体外钝化作用
從表1可见：用‘K326’各部位提取物溶液对病毒提取液钝化处理后接种烟叶，‘K326’全株及根、茎、叶的甲醇提取物对TMV均表现出一定钝化作用；根、茎部甲醇提取物活性高于全株提取物，抑制率分别为74.50%和37.56%；对根部甲醇提取物用不同极性溶剂萃取后，较根部甲醇提取物，乙酸乙酯萃取物活性稍有增强，对TMV侵染的抑制率达到76.81%，其他极性溶剂萃取物活性降低。
1） 数字上标表示显著性分析组别，不同字母表示组内差异显著（P<0.05）；下同。
Numeric superscript indicates the groups and different lowercase letters indicates significant difference （P<0.05）； the same below. 2.1.2保护作用
从表2可见：在TMV侵染过程中，‘K326’各部位的甲醇提取物对TMV寄主均表现出一定的保护作用，根和茎的甲醇提取物活性高于全株甲醇提取物，对TMV侵染抑制率分别达到68.82%和59.46%；对根部甲醇提取物用不同极性溶剂萃取后，较根部甲醇提取物，乙酸乙酯萃取物活性增强明显，对TMV寄主的保护作用达到78.02%。
2.1.3治疗作用
从表3可见：TMV侵染初期，除烟叶的甲醇提取物外，‘K326’各部位甲醇提取物对TMV侵染均表现出一定的治疗作用，根和茎的甲醇提取物活性高于全株提取物，对TMV侵染的抑制率分别为47.76%和42.40%；对根部甲醇提取物用不同极性溶剂萃取后，较根部甲醇提取物，乙酸乙酯和石油醚萃取物对TMV侵染的治疗作用明显增强，抑制率分别为61.42%和53.78%。
2.2根部提取物对TMV增殖的抑制活性
为了进一步验证‘K326’根部提取物对TMV的抑制活性，我们在普通烟‘K326’上采用圆盘悬浮筛选法对‘K326’根部甲醇提取物、乙酸乙酯、石油醚萃取物对TMV增殖的抑制活性进行测定。从图1可见：通过0.1、1、10 mg/mL 3个浓度的筛选发现，随着样品浓度的提高，3个提取物对TMV增殖的抑制率逐渐提高，表现出显著的剂量效应；3种浓度下，均以乙酸乙酯萃取物活性最强，石油醚萃取物活性最弱。
3讨论
烟草中的化学成分极为复杂，近几十年来，国内外研究者对烟草进行了大量研究，从中发现并鉴定的化学成分已有2 549种。同时，学者也从烟草中发现了具有抗病毒作用的活性物质，Cotelle等发现，烟草中酚类化合物对清除自由基作用良好，并且富含抗氧化活性[1718]。流行病学研究表明，抗氧化化合物一般都具有一定的抗病毒活性[1920]。Ohnishi等也发现烟草中含量较高的绿原酸的水解产物咖啡酸具有抑制单纯疱疹病毒的功效[21]。德国Free大学Eich教授在研究植物次生代谢物作为抗逆转录病毒剂时，发现绿原酸及其衍生物具有较好的抗艾滋病毒（HIV）活性[2122]。
以上研究主要是烟草中活性物质在抗人类疾病中的应用，但对其在对抗自然界逆境而形成的抵御病害的化学防御物质却涉猎较少。本研究基于烟草种植过程中发现的自然现象，首次从化学防御角度对‘K326’在对抗TMV侵袭过程中产生的防御物质进行了初步研究。发现‘K326’的全株、根、茎和叶的甲醇提取物对TMV体外钝化、初侵染和复制增殖均具有一定的抑制活性，根的甲醇提取物活性最强；对根部甲醇提取物用不同极性溶剂萃取后，较根部甲醇提取物，乙酸乙酯萃取物活性增强明显，石油醚、水和正丁醇萃取物活性均不同程度降低；经对根部甲醇提取物、乙酸乙酯、石油醚萃取物活性进一步验证，3个提取物均表现出明显的剂量效应，乙酸乙酯萃取物活性最强。以上结果表明，‘K326’中抗TMV 化学防御物质可能存在于根部甲醇提取物的乙酸乙酯萃取物中，在今后的研究中我们将对根部甲醇提取物的乙酸乙酯萃取物进行跟踪提取分离鉴定，对其抗TMV 化学防御物质进一步研究发掘。
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（责任编辑：田喆）