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【摘要】 本文介绍了用标准曲线法测定硫酸庆大霉素注射液的抗生素效价，其浓度在4.2～10.5U·mL-1范围内菌圈清晰，标准品菌圈直径与中心浓度菌圈的差与抗生素浓度对数线性关系良好（r=0.99866），结果重复性好，效果满意。
【关键词】 标准曲线法；抗生素效价；硫酸庆大霉素注射液。
硫酸庆大霉素注射液属氨基糖甙类药物，对各种革兰阴性细菌及革兰阳性细菌都有良好的抗菌作用，对各种肠杆菌科细菌如大肠埃希菌、克雷伯菌属、变形杆菌属、沙门菌属、志贺菌属、肠杆菌属、沙雷菌属及铜绿假单胞菌等有良好的抗菌作用。《中国药典》2010年版规定，用二剂量法或三剂量法测定其抗生素微生素效价，本文利用标准曲线法（又称一剂量法）测定其效价，取得良好的效果。
1 仪器、试药与菌种
1.1 仪器 选取CAM-III型抑菌圈自动测量仪（上海波浦电脑系统工程有限公司）、H.S电恒温水浴锅（上海医疗器械厂）、隔水式PYX-DHS-40X5型电热恒温培养箱（国营创新医疗器械厂）、AE200电子天平（METTLER）LXB50L型立式自动电热压力蒸汽灭菌器（合肥华泰医疗设备有限公司）、测定抗生素效价用培养皿（直径90mm）、牛津杯、陶瓦盖等。
1.2 试药及菌种 磷酸二氢钾（分析纯）、磷酸氢二钾（分析纯）、硫酸庆大霉素注射液（规格2mL：8万单位）批号 20100807 20110504 20110406 20110410）（河南汇源药业有限公司生产）、抗生素检定培养基I（pH7.8～8.0）（中国药品生物制品检定所提供）、短小芽胞杆菌〔CM CC（B）63 202〕（河南省药检所提供）。
2 实验方法与结果
2.1 磷酸盐缓冲液（pH值为7.8）的配制 取磷酸氢二钾11.18g与磷酸二氢钾0.82g，加水使成2000mL。滤过，在115℃灭菌30min。
2.2 短小芽孢杆菌菌液的制备 取短小芽胞杆菌营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在35～37℃培养7天，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上，用灭菌水将芽孢洗上在65℃加热30min，备用。
2.3 双碟的制备 取直径约90mm、高16mm～17mm的平底双碟，分别注入加热融化的抗生素检定培养基120mL，使在碟底内均匀摊布，放置水平台上使凝固，作为底层。另取抗生素检定培养基适量加热融化后，放冷至60℃，加入短小芽胞杆菌菌悬液适量（能得清晰的抑菌圈为度，使标准品溶液的中心浓度所致的抑菌圈直径为5～17mm）摇匀，在每1双碟中分别加入5mL，使在底层上均匀摊布，作为菌层。放置水平台上冷却后，在每1双碟中以等距离均匀放置牛津杯6个，用陶瓦圆盖覆盖备用。
2.4 标准曲线制备
2.4.1 中心浓度的选择 根据抗生素的对数浓度（剂量）与抑菌圈（反应）关系的直线范围内选择一个中心浓度C0＝6.8u·mL-1。
2.4.2 标准溶液浓度的确定 各剂量按等比级数稀释，剂距为1：0.86，算出中心剂量邻近的高低2个浓度，C0+1及C0-1，再分别计算各剂量的浓度，各种浓度CK（k1-k8）分别为4.2u·mL-1、4.8u·mL-1、5.5u·mL-1、6.4u·mL-1、7.2u·mL-1、8.2u·mL-1、9.2u·mL-1、10.5u·mL-1。
2.4.3 标准硫酸庆大霉溶液的制备 精密称取庆大霉素标准品，用灭菌水制成1000u·mL-1，精密吸取10mL至100mL量瓶中，加上述来菌缓冲液（pH为7.8）稀释成100u·mL-1。再分别精密吸取6.8mL、4.2mL、4.8mL、5.5mL、6.4mL、7.2mL、8.2mL、9.2mL、10.5mL至100mL容量瓶中，用磷酸盐缓冲液（pH为7.8）稀释至刻度，制成中心浓度为6.8u·mL-1及CK k1-k8各种浓度的标准溶液。
2.4.4 标准曲线的制定 取备妥的双碟24只，分为8组，每组3只，每组各碟内间隔的3枚牛津杯内分别滴满标准品，Ck1~8，即4.2……7.4u·mL-1溶液；另3杯牛津杯内均滴满标准品的中心浓度C0即5.6u·mL-1溶液。在36℃培养14～16h后，逐一测量每个抑菌圈直径。分别求得每组3个双碟中心浓度C0所致的抑菌直径平均值y0即C1~C8所致抑菌圈直径的平均值，yk（即Ck＝1～8）。令fx＝yk-y0，分别计算值，则8组双碟可得出f1~8的8个反应参数（见表1）。以fk值为横坐标，以相应的抗生素浓度对数为纵坐标，在方格纸上标点，将各点联结即成标准曲线（见图1）；或经计算，得出回归曲线直线方程式：Y＝0.15462X+1.31984，相关系数：r＝0.99866。
2.5 供试品效价测定
2.5.1 供试品效价测定方法 取标准品制备中心浓度的标准液，并取供试品，预估效价后，精密量取5mL，加灭菌水制成每1mL中约含1000u的溶液，摇匀，静置，精密量取上清液适量，用磷酸盐缓冲液（pH为7.8）稀释到与标准品的中心浓度相同的供试液。取备妥的放置6杯牛津杯的双碟，一般不小于3个，在每一双碟中间隔的3枚牛津杯中分别滴满中心浓度的标准液，另3枚牛津杯中滴满供试液。在36℃培养14～16h后，测量各抑菌圈的直径。分别求得标准液抑菌圈的直径和标准液抑菌圈直径平均值y及供试液抑菌圈直径的平均值yk，算出的差数（fk）。据此在标准曲线上读取供试液的浓度，即可转换成供试品所含效价u·mL-1，亦可以代入直线回归方程式，算出供试品的效价。
2.5.2 供试品效价的测定效果 用此法测定硫酸庆大霉素注射液批号分别为20100807、20110504、20110406、20110410，并与二剂量法比较，结果见表2。
2.6 重复性试验取硫酸庆大霉素注射液（批号为20110410），按本法测定6份，其平均值为98.6%，RSD为1.37%。
3 讨论
本法测定硫酸庆大霉素注射液抗生素效价，选择标准品中心浓度为6.8u·mL-1，加菌液适量可现直径在15~17cm的菌圈，其菌圈边缘清晰。本法与二剂量法比较，结果无显著差异，虽操作繁，但结果准确，重复性好。
参考文献
［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典［S］.北京：化学工业出版社，2010，977：93-98.
［2］ 马绪荣，苏德模.药品微生物学检验手册〔M〕.北京：科学出版社，2001：231-234.
【关键词】 标准曲线法；抗生素效价；硫酸庆大霉素注射液。
硫酸庆大霉素注射液属氨基糖甙类药物，对各种革兰阴性细菌及革兰阳性细菌都有良好的抗菌作用，对各种肠杆菌科细菌如大肠埃希菌、克雷伯菌属、变形杆菌属、沙门菌属、志贺菌属、肠杆菌属、沙雷菌属及铜绿假单胞菌等有良好的抗菌作用。《中国药典》2010年版规定，用二剂量法或三剂量法测定其抗生素微生素效价，本文利用标准曲线法（又称一剂量法）测定其效价，取得良好的效果。
1 仪器、试药与菌种
1.1 仪器 选取CAM-III型抑菌圈自动测量仪（上海波浦电脑系统工程有限公司）、H.S电恒温水浴锅（上海医疗器械厂）、隔水式PYX-DHS-40X5型电热恒温培养箱（国营创新医疗器械厂）、AE200电子天平（METTLER）LXB50L型立式自动电热压力蒸汽灭菌器（合肥华泰医疗设备有限公司）、测定抗生素效价用培养皿（直径90mm）、牛津杯、陶瓦盖等。
1.2 试药及菌种 磷酸二氢钾（分析纯）、磷酸氢二钾（分析纯）、硫酸庆大霉素注射液（规格2mL：8万单位）批号 20100807 20110504 20110406 20110410）（河南汇源药业有限公司生产）、抗生素检定培养基I（pH7.8～8.0）（中国药品生物制品检定所提供）、短小芽胞杆菌〔CM CC（B）63 202〕（河南省药检所提供）。
2 实验方法与结果
2.1 磷酸盐缓冲液（pH值为7.8）的配制 取磷酸氢二钾11.18g与磷酸二氢钾0.82g，加水使成2000mL。滤过，在115℃灭菌30min。
2.2 短小芽孢杆菌菌液的制备 取短小芽胞杆菌营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在35～37℃培养7天，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上，用灭菌水将芽孢洗上在65℃加热30min，备用。
2.3 双碟的制备 取直径约90mm、高16mm～17mm的平底双碟，分别注入加热融化的抗生素检定培养基120mL，使在碟底内均匀摊布，放置水平台上使凝固，作为底层。另取抗生素检定培养基适量加热融化后，放冷至60℃，加入短小芽胞杆菌菌悬液适量（能得清晰的抑菌圈为度，使标准品溶液的中心浓度所致的抑菌圈直径为5～17mm）摇匀，在每1双碟中分别加入5mL，使在底层上均匀摊布，作为菌层。放置水平台上冷却后，在每1双碟中以等距离均匀放置牛津杯6个，用陶瓦圆盖覆盖备用。
2.4 标准曲线制备
2.4.1 中心浓度的选择 根据抗生素的对数浓度（剂量）与抑菌圈（反应）关系的直线范围内选择一个中心浓度C0＝6.8u·mL-1。
2.4.2 标准溶液浓度的确定 各剂量按等比级数稀释，剂距为1：0.86，算出中心剂量邻近的高低2个浓度，C0+1及C0-1，再分别计算各剂量的浓度，各种浓度CK（k1-k8）分别为4.2u·mL-1、4.8u·mL-1、5.5u·mL-1、6.4u·mL-1、7.2u·mL-1、8.2u·mL-1、9.2u·mL-1、10.5u·mL-1。
2.4.3 标准硫酸庆大霉溶液的制备 精密称取庆大霉素标准品，用灭菌水制成1000u·mL-1，精密吸取10mL至100mL量瓶中，加上述来菌缓冲液（pH为7.8）稀释成100u·mL-1。再分别精密吸取6.8mL、4.2mL、4.8mL、5.5mL、6.4mL、7.2mL、8.2mL、9.2mL、10.5mL至100mL容量瓶中，用磷酸盐缓冲液（pH为7.8）稀释至刻度，制成中心浓度为6.8u·mL-1及CK k1-k8各种浓度的标准溶液。
2.4.4 标准曲线的制定 取备妥的双碟24只，分为8组，每组3只，每组各碟内间隔的3枚牛津杯内分别滴满标准品，Ck1~8，即4.2……7.4u·mL-1溶液；另3杯牛津杯内均滴满标准品的中心浓度C0即5.6u·mL-1溶液。在36℃培养14～16h后，逐一测量每个抑菌圈直径。分别求得每组3个双碟中心浓度C0所致的抑菌直径平均值y0即C1~C8所致抑菌圈直径的平均值，yk（即Ck＝1～8）。令fx＝yk-y0，分别计算值，则8组双碟可得出f1~8的8个反应参数（见表1）。以fk值为横坐标，以相应的抗生素浓度对数为纵坐标，在方格纸上标点，将各点联结即成标准曲线（见图1）；或经计算，得出回归曲线直线方程式：Y＝0.15462X+1.31984，相关系数：r＝0.99866。
2.5 供试品效价测定
2.5.1 供试品效价测定方法 取标准品制备中心浓度的标准液，并取供试品，预估效价后，精密量取5mL，加灭菌水制成每1mL中约含1000u的溶液，摇匀，静置，精密量取上清液适量，用磷酸盐缓冲液（pH为7.8）稀释到与标准品的中心浓度相同的供试液。取备妥的放置6杯牛津杯的双碟，一般不小于3个，在每一双碟中间隔的3枚牛津杯中分别滴满中心浓度的标准液，另3枚牛津杯中滴满供试液。在36℃培养14～16h后，测量各抑菌圈的直径。分别求得标准液抑菌圈的直径和标准液抑菌圈直径平均值y及供试液抑菌圈直径的平均值yk，算出的差数（fk）。据此在标准曲线上读取供试液的浓度，即可转换成供试品所含效价u·mL-1，亦可以代入直线回归方程式，算出供试品的效价。
2.5.2 供试品效价的测定效果 用此法测定硫酸庆大霉素注射液批号分别为20100807、20110504、20110406、20110410，并与二剂量法比较，结果见表2。
2.6 重复性试验取硫酸庆大霉素注射液（批号为20110410），按本法测定6份，其平均值为98.6%，RSD为1.37%。
3 讨论
本法测定硫酸庆大霉素注射液抗生素效价，选择标准品中心浓度为6.8u·mL-1，加菌液适量可现直径在15~17cm的菌圈，其菌圈边缘清晰。本法与二剂量法比较，结果无显著差异，虽操作繁，但结果准确，重复性好。
参考文献
［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典［S］.北京：化学工业出版社，2010，977：93-98.
［2］ 马绪荣，苏德模.药品微生物学检验手册〔M〕.北京：科学出版社，2001：231-234.