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摘 要:目的:研究和优化从海参加工废液中提取海参皂苷的工艺,为海参皂苷的规模化生产创造条件。方法:本文利用AB-8大孔树脂从海参加工废弃液中提取分离海参皂苷,并采用正交设计进行了提取工艺条件的优化。结果:经研究和优化确定了海参皂苷的最佳提取条件:海参废弃液pH值为10、上样速率为2倍柱体积(BV)/h、洗脱用乙醇浓度为70%、洗脱体积为6倍柱体积。性质鉴定结果显示,海参皂苷在Molish 反应、泡沫实验、沉淀实验和Libermann-Burchard 反应中均呈阳性,表明所得提取物确为皂苷;结论:本文确定了利用AB-8型大孔树脂提取海参皂苷的最佳工艺,为海参皂苷的规模化生产奠定了基础。
关键词:海参海参皂苷 AB-8大孔树脂 正交试验
中图分类号:R93 文献标识码:A 文章编号:1674-098X(2011)01(b)-0014-02
海参(sea cucumber)隶属于棘皮动物门(Echinoermata)、游走亚门(Eleutherozoa)、海参纲(Holothuroidea)、盾手目(Aspidochirota)。全世界约有海参1100余种,其中可食用者有40余种。在我国,海参不仅一向被视为具有显著滋补作用的美味佳肴,而且作为药用的历史也非常悠久,据查证,海参早在明代就被作为补益药收入《食物本草》。
研究表明,海参中所富含的皂苷类物质具有广泛的生理学和药理学活性,如抗真菌、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、提高免疫力等[1-3]。1969年,人类首次从海参中获得了具有抗真菌活性的皂苷类物质[4]。1976年,日本学者Kitagawa便从刺参(stichopus japonicus shlenka)中分离出具有显著抗真菌活性的皂苷类物质,holotoxin A和B[5],现已经成为脚气和脚癣的治疗药物。此后,对棘皮动物皂苷的研究倍受学者们关注。
鲜海参体内因具有自溶酶,因此在加工过程中,首先要用沸水煮制进行灭酶处理,但在煮制过程中,有许多营养成分和功效成分会流失在加工废液中,尤其是极性较大的皂苷类成分,如果能进行再利用不仅可避免因直接排放所引起的环境污染而且还能避免大量海参皂苷的流失,对于开发纯天然抗真菌海洋药物将具有重要意义。
目前,对海参皂苷的提取主要采用乙醇或甲醇等有机溶剂的萃取法[3]。但这类方法有机溶剂的使用量大、成本高、易污染环境、不适于工业化生产。为此,本文研究、优化和建立了利用AB-8大孔树脂从海参加工废弃液中提取海参皂苷的最优技术工艺,为利用海参废弃液规模化提取海参皂苷奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
材料:海参加工废弃液,由好当家集团有限公司提供。
试剂:石油醚、正丁醇、无水乙醇均为分析醇。
1.2 大孔树脂预处理
精确称取AB-8型大孔吸附树脂(天津南开化工厂)60g,用95%乙醇浸泡24h后装柱(30mm×300mm,柱体积约为50mL)。用95%乙醇洗柱,流速为2倍柱体积(BV)/h,至洗脱液加水不出现白色混浊为止,经去离子水洗柱至无醇味后再用200mL的5%HCl溶液洗柱(流速2～4BV/h)并浸泡4h进行酸处理,经去离子水洗至中性后,最后用200 mL的2%NaOH溶液洗柱(流速2～4BV/h)并浸泡4h进行碱处理。
海参皂苷的提取。
取同一批次的海参加工废弃液500mL,调节pH值(9、10、11)后,8000r/min离心40 min,收集上清液上样于预处理AB-8型大孔吸附树脂柱,控制上样速率(2、3、4 BV/h),经去离子水和20%乙醇溶液分别洗柱后,用乙醇溶液(50%、70%、90%)进行洗脱,设定洗脱体积(2、4、6BV),收集洗脱组分,减压浓缩至浸膏状,浸膏用40mL去离子水复溶后,8000r/min离心40min,上清液经石油醚萃取脱脂后,水层利用水饱和正丁醇萃取三次,合并正丁醇层,减压浓缩至浸膏状,冷冻干燥后备用。
1.3 正交设计优化提取工艺
选择制备工艺中对皂苷收率具有显著影响的4种因素:海参加工废弃液pH值、上样速率、乙醇洗脱剂的浓度、洗脱体积,每种因素选择3个不同水平,采用4因素3水平的正交实验表L9(34)制备海参皂苷(详见表1),每个水平设3次平行实验,分析不同水平的4种因素对海参皂苷收率的影响。
1.4 海参皂苷的性质鉴定
皂苷的性质鉴定参照张继杰(1997)的方法进行[7]。泡沫试验:取海参皂苷冻干品5mg,完全溶解于2mL去离子水中,振荡1min后,观察泡沫的产生情况。沉淀反应:取海参皂苷冻干品5mg,完全溶解于1mL去离子水中,加入少许氯化钡,充分摇匀溶解后,观察白色沉淀的有无。Molish反应:取海参皂苷冻干品5mg,完全溶解于2mL去离子水中,加入2～3滴10%α-萘酚醇溶液,充分摇匀后,沿离心管壁加入1mL浓硫酸,观察两液层交界面处紫色环的出现情况。Libermann Burchard反应:称取海参皂苷冻干品5mg,加3mL醋酐充分溶解后,加入1滴浓硫酸,充分摇匀,观察颜色的变化情况。
1.5 实验数据的统计学处理
正交实验数据用正交设计软件进行处理。
2 结果与分析
2.1 海参皂苷制备技术工艺的正交实验
以海参皂苷制品的收率(重量)为指标,按照表1中的L9(34)正交实验顺序,4种因素3个水平AB-8大孔树脂提取海参皂苷收率的正交实验结果见表2,其方差分析见表3。
由表2,3可知,利用AB-8大孔树脂从海参加工废弃液中提取海参皂苷,各因素对海参皂苷收率的影响为:C＞D＞B＞A。在实验范围内,最佳优选条件组合为C2D3B1A2,即海参加工废弃液pH值为10、上样速率为2BV/h、洗脱用乙醇浓度为70%,洗脱体积为6 BV。
2.2 海参皂苷制品的性质鉴定
对海参皂苷制品的性质鉴定结果见表4。制品的水溶液经振荡后产生了持久的泡沫,说明样品中可能含有蛋白、皂苷类物质;皂苷制品在Libermann Burchard反应中呈阳性,说明有三萜类皂苷的存在;皂苷制品在沉淀反应、Molish反应中也呈阳性,进一步证明了其确具有皂苷的性质。
3 讨论
海参皂苷作为海参的次生代谢产物,除对酵母菌、霉菌等多种真菌有很强的抗真菌活性外,还具有显著的抗肿瘤活性以及多种免疫调节作用[5,6],因此海参皂苷是海洋抗真菌药物等研制的重要候选者。目前,对海参皂苷的分离纯化多采用醇提取、大孔树脂柱层析、硅胶柱层析和HPLC等技术方法[7,8,9],但这些方法操作繁琐,不适于海参皂苷的工业化生产。为了解决这一问题,我们在业已建立的海参皂苷提取方法的基础上,通过正交实验对利用AB-8大孔树脂提取海参皂苷的技术工艺进行了优化,旨在建立利用海参加工废弃液规模化生产海参皂苷的最佳技术工艺,为将海参皂苷早日开发为抗真菌海洋药物奠定基础。
在利用AB-8大孔树脂提取海参加工废液海参皂苷的技术工艺中,废弃液的pH值、上样速率、洗脱剂乙醇的浓度和洗脱体积等因素对皂苷的收率均具有很大的影响,对皂苷的规模化生产至关重要。因此,本文选择了这4种因素的3个水平进行了正交实验。实验结果证明,洗脱剂乙醇的浓度对海参皂苷收率的影响作用最大,洗脱体积次之,上样速率和废弃液pH值的影响作用较小。在上述条件下所提取的海参皂苷在泡沫实验、Molish反应、沉淀实验、Libermann-Burchard反应中均呈现为阳性,说明提取物确为皂苷类物质。从而确定了利用AB-8大孔树脂提取海参皂苷的最佳技术条件:海参加工废弃液→调pH至10→上样于AB-8大孔树脂(上样速率:2×柱体积/h)→去离子水洗柱→50%乙醇洗柱→70%乙醇洗脱(6×柱体积)→收集洗脱组分→减压浓缩→去离子水复溶→离心收集上清液→石油醚萃取脱脂→水饱和正丁醇萃取(3次)→合并正丁醇层→减压浓缩→冷冻干燥。
参考文献
[1] Pettit G R,Herald C L,Herald D L,et al. Antineoplastic agents XLV: sea cucumber cytototic saponin.J Pharm Sci,1976,65(10):1558-1559.
[2] Zou Z,Yi Y,Wu H,et al.Intercedensides D-I, cytotoxic triterpene glycosides from the sea cucumber Mensamaria intercedens Lampert.J Nat Prod,2005,68(4):540-546.
[3] 周峥嵘,易杨华,张淑瑜等.海参皂苷研究进展.中国海洋药物,2004(1):46-53.
[4] Shimada S. Antifungal steroid glycoside from sea cucumber. Science, 1969, 163(874):1462.
[5] Kitagawa I, Sugawara T, Yosioka. Saponin and sapogenol. XV. Antifungal glycosides from the sea cucumber Stichopus japonicus selenka(2). Structures of holotoxin A and holotoxin B.Chem Pharm Bull (Tokyo),1976,24(2):275-284.
[6] 丛日山,袁文鹏,樊廷俊,等.仿刺参水溶性皂苷的分离制备及抗真菌活性的研究.中国海洋大学学报,2006,36(6):959-964.
[7] Greta Moraes, Peter C. Norhcote, Vladimir I. Kalinin et al. Structure of the major triterpene glycoside from the sea cucumber Stichopus mollis and evidence to reclassify this species into the new genus Australostichopus. Biochemical Systematics and Ecology. 2004, 32(7):637-650.
[8] Vinod R.Hegde,T.-M. Chan,Haiyan Pu, et al.Two Selective Novel Triterpene Glycosides from Sea Cucumber, Telenata Ananas: Inhibitors of Chemokine Receptor-5. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 2002,12:3203-3205.
[9] Isabelle Bonnard, Kenneth L. Rinehart. Thyonosides A and B, two new saponins isolated from the holothurian Thyone aurea. Tetrahedron.2004, 60(13):2987-2992.
关键词:海参海参皂苷 AB-8大孔树脂 正交试验
中图分类号:R93 文献标识码:A 文章编号:1674-098X(2011)01(b)-0014-02
海参(sea cucumber)隶属于棘皮动物门(Echinoermata)、游走亚门(Eleutherozoa)、海参纲(Holothuroidea)、盾手目(Aspidochirota)。全世界约有海参1100余种,其中可食用者有40余种。在我国,海参不仅一向被视为具有显著滋补作用的美味佳肴,而且作为药用的历史也非常悠久,据查证,海参早在明代就被作为补益药收入《食物本草》。
研究表明,海参中所富含的皂苷类物质具有广泛的生理学和药理学活性,如抗真菌、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、提高免疫力等[1-3]。1969年,人类首次从海参中获得了具有抗真菌活性的皂苷类物质[4]。1976年,日本学者Kitagawa便从刺参(stichopus japonicus shlenka)中分离出具有显著抗真菌活性的皂苷类物质,holotoxin A和B[5],现已经成为脚气和脚癣的治疗药物。此后,对棘皮动物皂苷的研究倍受学者们关注。
鲜海参体内因具有自溶酶,因此在加工过程中,首先要用沸水煮制进行灭酶处理,但在煮制过程中,有许多营养成分和功效成分会流失在加工废液中,尤其是极性较大的皂苷类成分,如果能进行再利用不仅可避免因直接排放所引起的环境污染而且还能避免大量海参皂苷的流失,对于开发纯天然抗真菌海洋药物将具有重要意义。
目前,对海参皂苷的提取主要采用乙醇或甲醇等有机溶剂的萃取法[3]。但这类方法有机溶剂的使用量大、成本高、易污染环境、不适于工业化生产。为此,本文研究、优化和建立了利用AB-8大孔树脂从海参加工废弃液中提取海参皂苷的最优技术工艺,为利用海参废弃液规模化提取海参皂苷奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
材料:海参加工废弃液,由好当家集团有限公司提供。
试剂:石油醚、正丁醇、无水乙醇均为分析醇。
1.2 大孔树脂预处理
精确称取AB-8型大孔吸附树脂(天津南开化工厂)60g,用95%乙醇浸泡24h后装柱(30mm×300mm,柱体积约为50mL)。用95%乙醇洗柱,流速为2倍柱体积(BV)/h,至洗脱液加水不出现白色混浊为止,经去离子水洗柱至无醇味后再用200mL的5%HCl溶液洗柱(流速2～4BV/h)并浸泡4h进行酸处理,经去离子水洗至中性后,最后用200 mL的2%NaOH溶液洗柱(流速2～4BV/h)并浸泡4h进行碱处理。
海参皂苷的提取。
取同一批次的海参加工废弃液500mL,调节pH值(9、10、11)后,8000r/min离心40 min,收集上清液上样于预处理AB-8型大孔吸附树脂柱,控制上样速率(2、3、4 BV/h),经去离子水和20%乙醇溶液分别洗柱后,用乙醇溶液(50%、70%、90%)进行洗脱,设定洗脱体积(2、4、6BV),收集洗脱组分,减压浓缩至浸膏状,浸膏用40mL去离子水复溶后,8000r/min离心40min,上清液经石油醚萃取脱脂后,水层利用水饱和正丁醇萃取三次,合并正丁醇层,减压浓缩至浸膏状,冷冻干燥后备用。
1.3 正交设计优化提取工艺
选择制备工艺中对皂苷收率具有显著影响的4种因素:海参加工废弃液pH值、上样速率、乙醇洗脱剂的浓度、洗脱体积,每种因素选择3个不同水平,采用4因素3水平的正交实验表L9(34)制备海参皂苷(详见表1),每个水平设3次平行实验,分析不同水平的4种因素对海参皂苷收率的影响。
1.4 海参皂苷的性质鉴定
皂苷的性质鉴定参照张继杰(1997)的方法进行[7]。泡沫试验:取海参皂苷冻干品5mg,完全溶解于2mL去离子水中,振荡1min后,观察泡沫的产生情况。沉淀反应:取海参皂苷冻干品5mg,完全溶解于1mL去离子水中,加入少许氯化钡,充分摇匀溶解后,观察白色沉淀的有无。Molish反应:取海参皂苷冻干品5mg,完全溶解于2mL去离子水中,加入2～3滴10%α-萘酚醇溶液,充分摇匀后,沿离心管壁加入1mL浓硫酸,观察两液层交界面处紫色环的出现情况。Libermann Burchard反应:称取海参皂苷冻干品5mg,加3mL醋酐充分溶解后,加入1滴浓硫酸,充分摇匀,观察颜色的变化情况。
1.5 实验数据的统计学处理
正交实验数据用正交设计软件进行处理。
2 结果与分析
2.1 海参皂苷制备技术工艺的正交实验
以海参皂苷制品的收率(重量)为指标,按照表1中的L9(34)正交实验顺序,4种因素3个水平AB-8大孔树脂提取海参皂苷收率的正交实验结果见表2,其方差分析见表3。
由表2,3可知,利用AB-8大孔树脂从海参加工废弃液中提取海参皂苷,各因素对海参皂苷收率的影响为:C＞D＞B＞A。在实验范围内,最佳优选条件组合为C2D3B1A2,即海参加工废弃液pH值为10、上样速率为2BV/h、洗脱用乙醇浓度为70%,洗脱体积为6 BV。
2.2 海参皂苷制品的性质鉴定
对海参皂苷制品的性质鉴定结果见表4。制品的水溶液经振荡后产生了持久的泡沫,说明样品中可能含有蛋白、皂苷类物质;皂苷制品在Libermann Burchard反应中呈阳性,说明有三萜类皂苷的存在;皂苷制品在沉淀反应、Molish反应中也呈阳性,进一步证明了其确具有皂苷的性质。
3 讨论
海参皂苷作为海参的次生代谢产物,除对酵母菌、霉菌等多种真菌有很强的抗真菌活性外,还具有显著的抗肿瘤活性以及多种免疫调节作用[5,6],因此海参皂苷是海洋抗真菌药物等研制的重要候选者。目前,对海参皂苷的分离纯化多采用醇提取、大孔树脂柱层析、硅胶柱层析和HPLC等技术方法[7,8,9],但这些方法操作繁琐,不适于海参皂苷的工业化生产。为了解决这一问题,我们在业已建立的海参皂苷提取方法的基础上,通过正交实验对利用AB-8大孔树脂提取海参皂苷的技术工艺进行了优化,旨在建立利用海参加工废弃液规模化生产海参皂苷的最佳技术工艺,为将海参皂苷早日开发为抗真菌海洋药物奠定基础。
在利用AB-8大孔树脂提取海参加工废液海参皂苷的技术工艺中,废弃液的pH值、上样速率、洗脱剂乙醇的浓度和洗脱体积等因素对皂苷的收率均具有很大的影响,对皂苷的规模化生产至关重要。因此,本文选择了这4种因素的3个水平进行了正交实验。实验结果证明,洗脱剂乙醇的浓度对海参皂苷收率的影响作用最大,洗脱体积次之,上样速率和废弃液pH值的影响作用较小。在上述条件下所提取的海参皂苷在泡沫实验、Molish反应、沉淀实验、Libermann-Burchard反应中均呈现为阳性,说明提取物确为皂苷类物质。从而确定了利用AB-8大孔树脂提取海参皂苷的最佳技术条件:海参加工废弃液→调pH至10→上样于AB-8大孔树脂(上样速率:2×柱体积/h)→去离子水洗柱→50%乙醇洗柱→70%乙醇洗脱(6×柱体积)→收集洗脱组分→减压浓缩→去离子水复溶→离心收集上清液→石油醚萃取脱脂→水饱和正丁醇萃取(3次)→合并正丁醇层→减压浓缩→冷冻干燥。
参考文献
[1] Pettit G R,Herald C L,Herald D L,et al. Antineoplastic agents XLV: sea cucumber cytototic saponin.J Pharm Sci,1976,65(10):1558-1559.
[2] Zou Z,Yi Y,Wu H,et al.Intercedensides D-I, cytotoxic triterpene glycosides from the sea cucumber Mensamaria intercedens Lampert.J Nat Prod,2005,68(4):540-546.
[3] 周峥嵘,易杨华,张淑瑜等.海参皂苷研究进展.中国海洋药物,2004(1):46-53.
[4] Shimada S. Antifungal steroid glycoside from sea cucumber. Science, 1969, 163(874):1462.
[5] Kitagawa I, Sugawara T, Yosioka. Saponin and sapogenol. XV. Antifungal glycosides from the sea cucumber Stichopus japonicus selenka(2). Structures of holotoxin A and holotoxin B.Chem Pharm Bull (Tokyo),1976,24(2):275-284.
[6] 丛日山,袁文鹏,樊廷俊,等.仿刺参水溶性皂苷的分离制备及抗真菌活性的研究.中国海洋大学学报,2006,36(6):959-964.
[7] Greta Moraes, Peter C. Norhcote, Vladimir I. Kalinin et al. Structure of the major triterpene glycoside from the sea cucumber Stichopus mollis and evidence to reclassify this species into the new genus Australostichopus. Biochemical Systematics and Ecology. 2004, 32(7):637-650.
[8] Vinod R.Hegde,T.-M. Chan,Haiyan Pu, et al.Two Selective Novel Triterpene Glycosides from Sea Cucumber, Telenata Ananas: Inhibitors of Chemokine Receptor-5. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 2002,12:3203-3205.
[9] Isabelle Bonnard, Kenneth L. Rinehart. Thyonosides A and B, two new saponins isolated from the holothurian Thyone aurea. Tetrahedron.2004, 60(13):2987-2992.