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摘要
为明确死亡谷芽胞杆菌NBIF001菌株对棒孢叶斑病的防治效果，采用平板对峙结合显微观察确定其对多主棒孢的抑菌活性，并采用活体盆栽试验研究该菌株对番茄棒孢叶斑病防治效果。结果表明，在平板对峙条件下NBIF001对多主棒孢具有良好的抑菌活性，显微镜下观察到菌丝发生扭曲、肿胀和变形；盆栽试验结果表明 NBIF001对棒孢叶斑病的防治效果达到71.46%。NBIF001和50%啶酰菌胺WG联用防治番茄棒孢叶斑病的效果明显好于单独施用50%啶酰菌胺WG，具有较明显的增效作用，化学杀菌剂50%啶酰菌胺WG对NBIF001菌株生长无明显影响，两者具有较好的相容性。
关键词
死亡谷芽胞杆菌；棒孢叶斑病菌；生防效果
中图分类号：
S 476， S 436.412
文献标识码：B
DOI：10.3969/j.issn.05291542.2017.06.034
Control effect of Bacillus vallismortis NBIF001 on
Corynespora leaf spot of tomato
Huang Daye1，Ben Haiyan2，Cao Chunxia1，Wang Kaimei1，
Rao Ben1，Liu Xiaoyan1，Wan Zhongyi1，Yang Ziwen1
（1. Hubei Biopesticide Engineering Research Center， Wuhan430064， China； 2. Horticultural
Branch， Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences， Harbin150069， China）
Abstract
In order to evaluate control effect of Bacillus vallismortis NBIF001 on Corynespora leaf spot， the inhibition activity was tested by dual culture method and microscope observation， and the control efficacy was investigated by pot experiment. The results showed that the strain NBIF001 had high inhibition activity in dual culture， hypha deformed and cytoplasmic vacuoles enlarged. Pot experiment demonstrated that NBIF001 exhibited a better control effect on Corynespora leaf spot of tomato with the efficacy of 71.46%. NBIF001 combined with boscalid 50% WG had obvious synergic effect on the disease control. Bocalid showed no significant effect on the growth of NBIF001， thus they both had the good compatibility.
Key words
Bacillus vallismortis；Corynespora leaf spot；biological control effect
番茄棒孢叶斑病是由多主棒孢Corynespora cassiicola引起的一种世界性病害，在多数番茄种植区域都有发生，近年来传入我国，对我国番茄生产造成了严重的影响。多主棒孢除了侵染番茄，还能侵染黄瓜和茄子等蔬菜、花卉和橡胶等5 300余种植物[13]。目前，国内缺少针对多主棒孢的抗性品种，因此，防治该菌引起的病害主要依靠化学杀菌剂。但多主棒孢极易产生抗药性，目前已经报道其对苯并咪唑类、二甲酰亚胺类、乙霉威和甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂产生抗药性[46]。同时，化学杀菌剂的使用也会对人类健康和环境造成影响。基于上述原因，亟须更为安全有效的防治方法，近年来应用芽胞杆菌作为生防菌防控作物真菌和细菌性病害已经有大量报道，这些菌株从自然界中筛选出来，具有无污染无农药残留等优点，是一种理想的生防菌。
死亡谷芽胞杆菌Bacillus vallismortis NBIF001是由湖北省生物农药工程研究中心分离和保存的具有高杀菌活力的菌株（中国典型培养物中心保存号为CCTCC No：M2015087），前期研究表明其对多种植物病原菌有良好的抑制作用，本文研究了其对番茄棒孢叶斑病的防治效果，以期为以后的田间示范和应用推广奠定基础。
1材料与方法
1.1试验材料
菌株：死亡谷芽胞杆菌B.vallismortis NBIF001分离自云南香格里拉的松萝根际土壤；番茄棒孢叶斑病菌由湖北省生物农药工程研究中心分离保存。药剂：50%啶酰菌胺水分散粒剂（WG），德国巴斯夫。番茄品种为‘中杂109’。
1.2试验方法
1.2.1离体对峙试验
死亡谷芽胞杆菌NBIF001发酵液制备：将在冷冻甘油管保存的NBIF001接种于LB液体培养基中，25℃，180 r/min振荡培养18 h备用（饱和状态下计数为108 cfu/mL）。番茄棒孢葉斑病菌经PDA斜面活化5 d后用打孔器打取4 mm菌饼接种于PDA平板中央，在距离菌饼25 mm处等距离取4个点，每点接种NBIF001 5 μL。以不接种NBIF001作为对照，25℃培养6 d后观察NBIF001的抑菌效果。刮取抑菌带边缘棒孢叶斑病菌菌丝，在显微镜下（OLYMPUS CX21， Tokyo， Japan）观察其与对照菌丝形态上的区别。 1.2.2死亡谷芽胞桿菌防治番茄棒孢叶斑病及与啶酰菌胺联用增效作用
多主棒孢C.cassiicola孢子制备方法按照Miyamoto等的方法[7]。将斜面保存的多主棒孢接种到PDA平板上，25℃黑暗培养10 d后用无菌手术刀片刮去菌丝，于25℃下采用BLB（black light blue）灯培养3 d使其产孢。刷取孢子溶于无菌水中，调整孢子浓度到104 cfu/mL后备用。
NBIF001发酵液的制备方法同1.2.1。试验设4个处理：芽胞数为108 cfu/mL的NBIF001发酵液、NBIF001发酵液108 cfu/mL 50%啶酰菌胺WG 100 μg/mL （有效成分）、50%啶酰菌胺WG 100 μg/mL（药剂对照）和清水（空白对照）。
温室条件下播种催芽的番茄，常规管理下培养30 d后将各处理药液喷施于番茄叶片表面至饱和，每处理3个重复，每个重复32株番茄。24 h后喷雾接种病原菌孢子悬浮液至滴水，25℃保湿培养3 d，统计各处理病情指数并计算防效。病害分级按照Ishii等的标准[6]。0级：无病斑，0.1级：病斑占叶面积小于1%，0.5级：病斑占叶面积1%～5%；1级：病斑占叶面积6%～10%；2级：病斑占叶面积11%～20%；3级：病斑占叶面积21%～30%；4级：病斑占叶面积31%～40%；5级：病斑占叶面积41%～50%；6级：病斑占叶面积51%～60%；7级：病斑占叶面积61%～70%；8级：病斑占叶面积71%～80%；9级：病斑占叶面积81%～90%；10级：病斑占叶面积大于90%。
病情指数=∑（各级植株数×级别）/（调查总株数×最高代表级别）×100；
防治效果（%）=（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数×100。
1.2.3死亡谷芽胞杆菌和啶酰菌胺相容性
将5%啶酰菌胺WG加入含有50 mL LB的三角瓶中，使其终浓度为50、100和200 μg/mL，以加入无菌水作为对照。随后加入100 μL 108 cfu/mL NBIF001发酵液。25℃，180 r/min振荡培养，在24、48和72 h后通过稀释法测定各处理和对照菌落数，每个处理3次重复。
2结果与分析
2.1死亡谷芽胞杆菌NBIF001对棒孢叶斑病菌离体抑制效果
离体对峙培养6 d后可以观察到棒孢叶斑病菌和NBIF001之间有明显抑菌带（图1），在光学显微镜下可以观察到，与对照菌丝相比，抑菌带边缘棒孢叶斑病菌菌丝发生扭曲和肿胀变形（图2）。
2.2死亡谷芽胞杆菌防治番茄棒孢叶斑病及与啶酰菌胺联用增效作用
温室盆栽试验结果表明，死亡谷芽胞杆菌NBIF001 108 cfu/mL发酵液对番茄棒孢叶斑病具有良好的防治效果，施用后番茄植株的病情指数明显低于对照，其防治效果略低于对照药剂50%啶酰菌胺WG 100 μg/mL的防治效果。
死亡谷芽胞杆菌NBIF001 108 cfu/mL与50%啶酰菌胺WG 100 μg/mL联合使用的防效高于单独使用50%啶酰菌胺WG 100 μg/mL的防效，但两者之间差异未达到显著水平。
2.3NBIF001菌株与啶酰菌胺相容性
当NBIF001菌株在含有50、100和200 μg/mL 50%啶酰菌胺WG的LB液体培养基中振荡培养时，各浓度处理下NBIF001的菌落数与清水对照差别较小。24 h后各处理和对照的NBIF001生长均接近饱和。这些结果显示啶酰菌胺对NBIF001菌株生长没有影响（图3）。
3结论与讨论
芽胞杆菌是土壤中重要的生物群体，其生长快，所需营养简单，易分离培养，抗逆性强，可作为生防菌剂[8]。田间应用表明芽胞杆菌生防菌剂在稳定性、与化学农药的相容性等方面明显优于其他生防菌[9]。
多主棒孢极易产生抗药性，研究表明，在黄瓜大棚中，同一化学药剂连续喷施3次以上，多主棒孢抗药性菌株出现的几率显著增加。因此，在棒孢叶斑病的防治过程中减少杀菌剂的使用频率和剂量才能抑制抗药菌株的出现[7]。作者前期研究表明，我国由多主棒孢引起的蔬菜棒孢叶斑病对多菌灵产生了严重的抗药性，使之不能用于棒孢叶斑病的防治，推测可能是由于种子带菌长距离传播造成抗性种群的扩散 [10]。因此寻找其他防治方法显得极为重要，芽胞杆菌作为生防因子是进行抗性菌株治理的重要途径。
NBIF001菌株对多主棒孢具有良好的防治效果，与啶酰菌胺联用具有明显的增效作用和良好的相容性，生产上可以与其进行交替或混合使用，有利于缓解抗性压力。其作用机理、发酵条件、剂型加工、应用技术田间防治效果等需要进一步的研究，为今后的产品开发和应用奠定基础。
参考文献
[1]高苇， 李宝聚， 石延霞， 等. 多主棒孢菌在黄瓜、番茄和茄子寄主上致病力的分化[J]. 园艺学报， 2011， 38（3）：465470.
[2]古松， 高先爱， 杨和平， 等. 黄石市设施蔬装棒孢叶斑病的发生特点与防治技术[J]. 中国蔬菜， 2016（3）： 8081.
[3]Smith L J， Datnoff L E， Pernezny K， et al. Phylogenetic and pathogenic characterization of Corynespora cassiicola isolates.[C]∥International Symposium on Tomato Diseases， 2009： 812.
[4]Hasama W， Morita S， Kato T.Control of Corynespora target leaf spot of cucumber by use of negativelycorrelated cross resistance between benzimidazole fungicides and diethofencarb[J]. Annals of the Phytopathological Society of Japan， 1991， 57： 319325. [5]Date H， Kataoka E， Tanina K， et al. Sensitivity of Corynespora cassiicola， causal agent of Corynespora leaf spot of cucumber， to thiophanatemethyl， diethofencarb and azoxystrobin [J].Japanese Journal of Phytopathology，2004，70（1）：1013.
[6]Ishii H， Yano K， Date H， et al. Molecular characterization and diagnosis of QoI resistance in cucumber and eggplant fungal pathogens [J]. Phytopathology， 2007， 97（11）： 145866.
[7]Miyamoto T， Ishii H， Seko T， et al. Occurrence of Corynespora cassiicola isolates resistant to boscalid on cucumber in Ibaraki Prefecture， Japan [J]. Plant Pathology， 2009， 58（6）：11441151.
[8]孫正祥， 纪春艳， 李云峰， 等. 香蕉枯萎病拮抗细菌的分离利选与鉴定[J]. 中国生物防治， 2008， 24（2）： 143147.
[9]Oostendorp M， Sikora R A.Seed treatment with antagonistic rhizobacteria for the suppression of Heterodera schachtii early root infection of sugar beet [J]. Revue Némato， 1989， 12（1）： 7783.
[10]Huang D Y， Shi Y X， Xie X W， et al. Sensitivity of Corynespora cassiicola to carbendazim and diethofencarb [J]. Journal of Pure and Applied Microbiology， 2013， 7（2）： 891898.
（责任编辑：杨明丽）
为明确死亡谷芽胞杆菌NBIF001菌株对棒孢叶斑病的防治效果，采用平板对峙结合显微观察确定其对多主棒孢的抑菌活性，并采用活体盆栽试验研究该菌株对番茄棒孢叶斑病防治效果。结果表明，在平板对峙条件下NBIF001对多主棒孢具有良好的抑菌活性，显微镜下观察到菌丝发生扭曲、肿胀和变形；盆栽试验结果表明 NBIF001对棒孢叶斑病的防治效果达到71.46%。NBIF001和50%啶酰菌胺WG联用防治番茄棒孢叶斑病的效果明显好于单独施用50%啶酰菌胺WG，具有较明显的增效作用，化学杀菌剂50%啶酰菌胺WG对NBIF001菌株生长无明显影响，两者具有较好的相容性。
关键词
死亡谷芽胞杆菌；棒孢叶斑病菌；生防效果
中图分类号：
S 476， S 436.412
文献标识码：B
DOI：10.3969/j.issn.05291542.2017.06.034
Control effect of Bacillus vallismortis NBIF001 on
Corynespora leaf spot of tomato
Huang Daye1，Ben Haiyan2，Cao Chunxia1，Wang Kaimei1，
Rao Ben1，Liu Xiaoyan1，Wan Zhongyi1，Yang Ziwen1
（1. Hubei Biopesticide Engineering Research Center， Wuhan430064， China； 2. Horticultural
Branch， Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences， Harbin150069， China）
Abstract
In order to evaluate control effect of Bacillus vallismortis NBIF001 on Corynespora leaf spot， the inhibition activity was tested by dual culture method and microscope observation， and the control efficacy was investigated by pot experiment. The results showed that the strain NBIF001 had high inhibition activity in dual culture， hypha deformed and cytoplasmic vacuoles enlarged. Pot experiment demonstrated that NBIF001 exhibited a better control effect on Corynespora leaf spot of tomato with the efficacy of 71.46%. NBIF001 combined with boscalid 50% WG had obvious synergic effect on the disease control. Bocalid showed no significant effect on the growth of NBIF001， thus they both had the good compatibility.
Key words
Bacillus vallismortis；Corynespora leaf spot；biological control effect
番茄棒孢叶斑病是由多主棒孢Corynespora cassiicola引起的一种世界性病害，在多数番茄种植区域都有发生，近年来传入我国，对我国番茄生产造成了严重的影响。多主棒孢除了侵染番茄，还能侵染黄瓜和茄子等蔬菜、花卉和橡胶等5 300余种植物[13]。目前，国内缺少针对多主棒孢的抗性品种，因此，防治该菌引起的病害主要依靠化学杀菌剂。但多主棒孢极易产生抗药性，目前已经报道其对苯并咪唑类、二甲酰亚胺类、乙霉威和甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂产生抗药性[46]。同时，化学杀菌剂的使用也会对人类健康和环境造成影响。基于上述原因，亟须更为安全有效的防治方法，近年来应用芽胞杆菌作为生防菌防控作物真菌和细菌性病害已经有大量报道，这些菌株从自然界中筛选出来，具有无污染无农药残留等优点，是一种理想的生防菌。
死亡谷芽胞杆菌Bacillus vallismortis NBIF001是由湖北省生物农药工程研究中心分离和保存的具有高杀菌活力的菌株（中国典型培养物中心保存号为CCTCC No：M2015087），前期研究表明其对多种植物病原菌有良好的抑制作用，本文研究了其对番茄棒孢叶斑病的防治效果，以期为以后的田间示范和应用推广奠定基础。
1材料与方法
1.1试验材料
菌株：死亡谷芽胞杆菌B.vallismortis NBIF001分离自云南香格里拉的松萝根际土壤；番茄棒孢叶斑病菌由湖北省生物农药工程研究中心分离保存。药剂：50%啶酰菌胺水分散粒剂（WG），德国巴斯夫。番茄品种为‘中杂109’。
1.2试验方法
1.2.1离体对峙试验
死亡谷芽胞杆菌NBIF001发酵液制备：将在冷冻甘油管保存的NBIF001接种于LB液体培养基中，25℃，180 r/min振荡培养18 h备用（饱和状态下计数为108 cfu/mL）。番茄棒孢葉斑病菌经PDA斜面活化5 d后用打孔器打取4 mm菌饼接种于PDA平板中央，在距离菌饼25 mm处等距离取4个点，每点接种NBIF001 5 μL。以不接种NBIF001作为对照，25℃培养6 d后观察NBIF001的抑菌效果。刮取抑菌带边缘棒孢叶斑病菌菌丝，在显微镜下（OLYMPUS CX21， Tokyo， Japan）观察其与对照菌丝形态上的区别。 1.2.2死亡谷芽胞桿菌防治番茄棒孢叶斑病及与啶酰菌胺联用增效作用
多主棒孢C.cassiicola孢子制备方法按照Miyamoto等的方法[7]。将斜面保存的多主棒孢接种到PDA平板上，25℃黑暗培养10 d后用无菌手术刀片刮去菌丝，于25℃下采用BLB（black light blue）灯培养3 d使其产孢。刷取孢子溶于无菌水中，调整孢子浓度到104 cfu/mL后备用。
NBIF001发酵液的制备方法同1.2.1。试验设4个处理：芽胞数为108 cfu/mL的NBIF001发酵液、NBIF001发酵液108 cfu/mL 50%啶酰菌胺WG 100 μg/mL （有效成分）、50%啶酰菌胺WG 100 μg/mL（药剂对照）和清水（空白对照）。
温室条件下播种催芽的番茄，常规管理下培养30 d后将各处理药液喷施于番茄叶片表面至饱和，每处理3个重复，每个重复32株番茄。24 h后喷雾接种病原菌孢子悬浮液至滴水，25℃保湿培养3 d，统计各处理病情指数并计算防效。病害分级按照Ishii等的标准[6]。0级：无病斑，0.1级：病斑占叶面积小于1%，0.5级：病斑占叶面积1%～5%；1级：病斑占叶面积6%～10%；2级：病斑占叶面积11%～20%；3级：病斑占叶面积21%～30%；4级：病斑占叶面积31%～40%；5级：病斑占叶面积41%～50%；6级：病斑占叶面积51%～60%；7级：病斑占叶面积61%～70%；8级：病斑占叶面积71%～80%；9级：病斑占叶面积81%～90%；10级：病斑占叶面积大于90%。
病情指数=∑（各级植株数×级别）/（调查总株数×最高代表级别）×100；
防治效果（%）=（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数×100。
1.2.3死亡谷芽胞杆菌和啶酰菌胺相容性
将5%啶酰菌胺WG加入含有50 mL LB的三角瓶中，使其终浓度为50、100和200 μg/mL，以加入无菌水作为对照。随后加入100 μL 108 cfu/mL NBIF001发酵液。25℃，180 r/min振荡培养，在24、48和72 h后通过稀释法测定各处理和对照菌落数，每个处理3次重复。
2结果与分析
2.1死亡谷芽胞杆菌NBIF001对棒孢叶斑病菌离体抑制效果
离体对峙培养6 d后可以观察到棒孢叶斑病菌和NBIF001之间有明显抑菌带（图1），在光学显微镜下可以观察到，与对照菌丝相比，抑菌带边缘棒孢叶斑病菌菌丝发生扭曲和肿胀变形（图2）。
2.2死亡谷芽胞杆菌防治番茄棒孢叶斑病及与啶酰菌胺联用增效作用
温室盆栽试验结果表明，死亡谷芽胞杆菌NBIF001 108 cfu/mL发酵液对番茄棒孢叶斑病具有良好的防治效果，施用后番茄植株的病情指数明显低于对照，其防治效果略低于对照药剂50%啶酰菌胺WG 100 μg/mL的防治效果。
死亡谷芽胞杆菌NBIF001 108 cfu/mL与50%啶酰菌胺WG 100 μg/mL联合使用的防效高于单独使用50%啶酰菌胺WG 100 μg/mL的防效，但两者之间差异未达到显著水平。
2.3NBIF001菌株与啶酰菌胺相容性
当NBIF001菌株在含有50、100和200 μg/mL 50%啶酰菌胺WG的LB液体培养基中振荡培养时，各浓度处理下NBIF001的菌落数与清水对照差别较小。24 h后各处理和对照的NBIF001生长均接近饱和。这些结果显示啶酰菌胺对NBIF001菌株生长没有影响（图3）。
3结论与讨论
芽胞杆菌是土壤中重要的生物群体，其生长快，所需营养简单，易分离培养，抗逆性强，可作为生防菌剂[8]。田间应用表明芽胞杆菌生防菌剂在稳定性、与化学农药的相容性等方面明显优于其他生防菌[9]。
多主棒孢极易产生抗药性，研究表明，在黄瓜大棚中，同一化学药剂连续喷施3次以上，多主棒孢抗药性菌株出现的几率显著增加。因此，在棒孢叶斑病的防治过程中减少杀菌剂的使用频率和剂量才能抑制抗药菌株的出现[7]。作者前期研究表明，我国由多主棒孢引起的蔬菜棒孢叶斑病对多菌灵产生了严重的抗药性，使之不能用于棒孢叶斑病的防治，推测可能是由于种子带菌长距离传播造成抗性种群的扩散 [10]。因此寻找其他防治方法显得极为重要，芽胞杆菌作为生防因子是进行抗性菌株治理的重要途径。
NBIF001菌株对多主棒孢具有良好的防治效果，与啶酰菌胺联用具有明显的增效作用和良好的相容性，生产上可以与其进行交替或混合使用，有利于缓解抗性压力。其作用机理、发酵条件、剂型加工、应用技术田间防治效果等需要进一步的研究，为今后的产品开发和应用奠定基础。
参考文献
[1]高苇， 李宝聚， 石延霞， 等. 多主棒孢菌在黄瓜、番茄和茄子寄主上致病力的分化[J]. 园艺学报， 2011， 38（3）：465470.
[2]古松， 高先爱， 杨和平， 等. 黄石市设施蔬装棒孢叶斑病的发生特点与防治技术[J]. 中国蔬菜， 2016（3）： 8081.
[3]Smith L J， Datnoff L E， Pernezny K， et al. Phylogenetic and pathogenic characterization of Corynespora cassiicola isolates.[C]∥International Symposium on Tomato Diseases， 2009： 812.
[4]Hasama W， Morita S， Kato T.Control of Corynespora target leaf spot of cucumber by use of negativelycorrelated cross resistance between benzimidazole fungicides and diethofencarb[J]. Annals of the Phytopathological Society of Japan， 1991， 57： 319325. [5]Date H， Kataoka E， Tanina K， et al. Sensitivity of Corynespora cassiicola， causal agent of Corynespora leaf spot of cucumber， to thiophanatemethyl， diethofencarb and azoxystrobin [J].Japanese Journal of Phytopathology，2004，70（1）：1013.
[6]Ishii H， Yano K， Date H， et al. Molecular characterization and diagnosis of QoI resistance in cucumber and eggplant fungal pathogens [J]. Phytopathology， 2007， 97（11）： 145866.
[7]Miyamoto T， Ishii H， Seko T， et al. Occurrence of Corynespora cassiicola isolates resistant to boscalid on cucumber in Ibaraki Prefecture， Japan [J]. Plant Pathology， 2009， 58（6）：11441151.
[8]孫正祥， 纪春艳， 李云峰， 等. 香蕉枯萎病拮抗细菌的分离利选与鉴定[J]. 中国生物防治， 2008， 24（2）： 143147.
[9]Oostendorp M， Sikora R A.Seed treatment with antagonistic rhizobacteria for the suppression of Heterodera schachtii early root infection of sugar beet [J]. Revue Némato， 1989， 12（1）： 7783.
[10]Huang D Y， Shi Y X， Xie X W， et al. Sensitivity of Corynespora cassiicola to carbendazim and diethofencarb [J]. Journal of Pure and Applied Microbiology， 2013， 7（2）： 891898.
（责任编辑：杨明丽）