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摘要：利用湖羊生产羊抗人ApoB，将人ApoB免疫原经湖羊皮下与皮内及淋巴结多点接种并进行多次加强免疫，建立利用湖羊生产人ApoB多抗血清免疫的新方法，获得高效价抗人ApoB抗体，并且采用琼脂扩散方法检测抗体效价。结果显示，5次免疫后的羊抗人ApoB多抗血清效价达210以上，试验结果达到预期，湖羊采用合适的免疫程序完全可以生产抗血清，经济效益可观。
关键词：湖羊；人ApoB；抗血清；琼脂扩散法
中图分类号： S852.5 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2015）03-0186-02
传统的畜禽养殖业利润较少，且受市场行情及疾病影响较大，抵御市场风险能力差，亟需转变传统养殖观念，提高养殖经济效益。把生物技术引入畜禽养殖业，以畜禽为载体，为人类生产各类生物制品（特定蛋白、特异性抗体、特殊材料等），既可以解决传统养殖利润低的问题，又可以为人类提供高品质蛋白，降低医疗成本。以羊生产羊抗人的抗体计算，1只羊利润约1万元，大大高于传统养羊的利润。载脂蛋白B（ApoB）被认为是包含载脂蛋白的脂蛋白的显著标记，ApoB是脂蛋白结构的限制因素[1]。研究表明，人ApoB对于糖尿病、急性冠状动脉综合征等心血管疾病的诊断及后期临床治疗具有重要意义[2]。目前通过免疫羊获得羊抗人抗体的效价不高，如何提高抗体效价是利用羊生产人抗体的主要限制因素之一。本研究利用湖羊制备人ApoB多抗血清，对原有的常规免疫程序加以改进，建立一套从湖羊免疫、血清采集到抗体效价检测的生产方法，旨在为增加养殖业附加值、提高养殖户收入提供依据。
1 材料与方法
1.1 试验动物
选用体质量约35 kg的健康青年湖羊25只，免疫前全部打上耳标，采用群养放牧饲养方式，白天放牧4 h，上午、下午各 2 h，晚上添加少量精料，有利于羊身体健壮，避免过肥，自动饮水，每天早晚各观察1次羊的健康状况。
1.2 抗原
人ApoB抗原自行制备，纯度高于98.5%，接种前0.1 mL抗原（含1 mg抗原） 1.9 mL无菌PBS 2 mL弗氏完全（或不完全）佐剂充分混合，制成4 mL免疫原乳剂备用。
1.3 湖羊免疫方法程序
首免：每只羊接种4 mL免疫原乳剂，注射方式为皮下与皮内注射，共计16个注射点。分别为颌下、背部皮下各2个点；后足窝皮下共2个点；前腹股沟皮内各2个点；后腹股沟皮内各3个点注射。二免：首次后第15天进行二免，皮下与淋巴结注射，共计18个注射点。分别为颌下、背部皮下各2个点；前腹股沟皮下各2个点；后腹股沟皮下各3个点；前后腹股沟淋巴结共计4个点。三免：二免后第10天进行三免，皮下注射，共计14个注射点。分别为颌下、背部皮下各2个点；前腹股沟皮下各2个点；后腹股沟皮下各3个点。四免：三免后第10天进行四免，免疫方式同三免。五免：四免后第10天进行五免，免疫方式同三免。
1.4 血清制备与血清效价测定
分别于三免、四免后7～8 d采静脉血5～10 mL进行血清分离，采用琼脂扩散法检测血清抗体效价，剩余血清 置于-20 ℃ 冰箱冻存，标注抗体效价。第5次免疫注射后第 7～10 天经抗体效价检测，若供血羊准备重复利用，则每只羊根据体质量采血280～320 mL；若供血羊不准备重复利用，则将所有血采完，根据羊的体质量一般可采血900～1 200 mL。将采得的全血放入容器内，38 ℃水浴中静置 1.5～2.0 h，使血清充分析出，取出置于4～5 ℃冰箱中保存過夜。
1.5 琼脂板配制
配制0.01 mol/L PBS液，配方为NaCl 4.25 g、磷酸氢二钠1.35 g、磷酸二氢钠0.195 g、蒸馏水500 mL混匀，pH 值74。取100 mL PBS液置于烧杯中，加入优质琼脂1 g，2%叠氮钠或1%硫柳汞1.0 mL，沸水中融化均匀，将已融化的琼脂趁热倒入平皿中，制成3 mm 厚的琼脂板，冷却后备用。
1.6 结果判定
分别设置标准阴性对照孔、标准阳性对照孔，在标准阳性对照孔与抗原孔之间出现明显的致密白色沉淀线，标准阴性孔不出现沉淀线的前提下，将被测孔与对照孔进行比对，以判定阴阳性。利用Excel软件记录数据，并进行相关分析。
2 结果与分析
2.1 血清的产出
从接种人ApoB抗原的羊体中，通过颈静脉采血10～20 mL，装于离心管中倾斜放置，放于38 ℃水浴箱中孵育 1.5～2.0 h，再放入4 ℃ 冰箱过夜。第2天在无菌操作台上操作，移液器吸取血清上清液，放于指形管中，在指形管标记人ApoB及日期成功获得人ApoB血清上清液。经离心沉淀分出血清，根据每批血清的抗体效价进行抗体标准浓度调整与稀释，分装后置于-20 ℃冰箱冷冻保存。
2.2 血清效价及检测效果
通过琼脂扩散法检测血清效价，结果表明，三免后，血清抗体效价为1 ∶26，四免时增长到1 ∶28，五免抗体效价为 1 ∶210，达到后续用于制备检测试剂盒或者其他医学用途的抗体水平（表1）。
2.3 抗体生成规律
如图1所示，以效价对log2作图，结果显示：四免后所采集抗人ApoB血清效价比三免提高2 个数量级（或更高），五免比四免提高2个数量级（或更高）。笔者认为，五免后7 d内抗体效价可能升幅不高，10～20 d左右抗体效价处于高平台期。
3 结论与讨论
联合检测载脂蛋白A 与载脂蛋白B（ApoB）对血脂的判断具有重要的临床价值[3-4]。由于ApoB在脂质组装、转运过程中起核心作用，ApoB基因的遗传变异可能帮助解释脂质水平与严重动脉粥样硬化、冠心病之间的关系。测定载脂蛋白及脂蛋白HDL、LDL对分析病理发生状态很有帮助。由此可见ApoB对于医学诊断及疾病治疗的重要性。目前生产大量抗血清，主要采用大型家畜，包括马、绵羊、山羊等，这类家畜寿命较长，容易管理，不必施行麻醉即可从颈静脉采集大量血液，故主要用于抗血清的商品化生产[6]。本试验的主要创新点在于免疫程序方面，常规的免疫程序中注射方式一般都为皮下注射，本试验中首免时将腹股沟的皮下调整为皮内注射，这样注射的好处是二免时淋巴结会肿大，方便进行淋巴结注射，淋巴结注射亦是本试验的创新点，淋巴结是重要的免疫器官，理论上抗体生成效率更高，本试验五免之后的抗体效价能达到210，达到预期水平，可用于后期的商业化生产，具有较高的经济收益。本试验需要免疫5次，抗体效价才能符合生产要求，一方面2种抗体效价检测方法不同，不具备可比性；另一方面推测免疫原本身在羊上不易产生高的效价，尚需进一步研究。
参考文献：
[1]Uchide T，Tohya Y，Onda K，et a1.Apolipoprotein B （apoB） concentrations in lipopmteins in cows [J]. Vet Med Sci，1997，59（8）：711-714.
[2]姜伟超，张德太，张 科，等. 糖尿病及急性冠状动脉综合征患者ApoB与ApoA1比值测定的临床意义[J]. 临床血液学杂志：输血与检验版，2013，26（6）：837-840.
[3]Hirata T，Fujioka M，Takahashi Ka，et al. ApoB C7623T polymorphism predicts risk for steroid-induced osteonecrosis of the femoral head after renal transplantation[J]. Journal of Orthopaedic Science，2007，12（3）：199-206.
[4]陈保生. 载脂蛋白的结构和功能与病毒病的预防和治疗[J]. 中国医学科学院学报，2007，29（3）：448-451.
关键词：湖羊；人ApoB；抗血清；琼脂扩散法
中图分类号： S852.5 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2015）03-0186-02
传统的畜禽养殖业利润较少，且受市场行情及疾病影响较大，抵御市场风险能力差，亟需转变传统养殖观念，提高养殖经济效益。把生物技术引入畜禽养殖业，以畜禽为载体，为人类生产各类生物制品（特定蛋白、特异性抗体、特殊材料等），既可以解决传统养殖利润低的问题，又可以为人类提供高品质蛋白，降低医疗成本。以羊生产羊抗人的抗体计算，1只羊利润约1万元，大大高于传统养羊的利润。载脂蛋白B（ApoB）被认为是包含载脂蛋白的脂蛋白的显著标记，ApoB是脂蛋白结构的限制因素[1]。研究表明，人ApoB对于糖尿病、急性冠状动脉综合征等心血管疾病的诊断及后期临床治疗具有重要意义[2]。目前通过免疫羊获得羊抗人抗体的效价不高，如何提高抗体效价是利用羊生产人抗体的主要限制因素之一。本研究利用湖羊制备人ApoB多抗血清，对原有的常规免疫程序加以改进，建立一套从湖羊免疫、血清采集到抗体效价检测的生产方法，旨在为增加养殖业附加值、提高养殖户收入提供依据。
1 材料与方法
1.1 试验动物
选用体质量约35 kg的健康青年湖羊25只，免疫前全部打上耳标，采用群养放牧饲养方式，白天放牧4 h，上午、下午各 2 h，晚上添加少量精料，有利于羊身体健壮，避免过肥，自动饮水，每天早晚各观察1次羊的健康状况。
1.2 抗原
人ApoB抗原自行制备，纯度高于98.5%，接种前0.1 mL抗原（含1 mg抗原） 1.9 mL无菌PBS 2 mL弗氏完全（或不完全）佐剂充分混合，制成4 mL免疫原乳剂备用。
1.3 湖羊免疫方法程序
首免：每只羊接种4 mL免疫原乳剂，注射方式为皮下与皮内注射，共计16个注射点。分别为颌下、背部皮下各2个点；后足窝皮下共2个点；前腹股沟皮内各2个点；后腹股沟皮内各3个点注射。二免：首次后第15天进行二免，皮下与淋巴结注射，共计18个注射点。分别为颌下、背部皮下各2个点；前腹股沟皮下各2个点；后腹股沟皮下各3个点；前后腹股沟淋巴结共计4个点。三免：二免后第10天进行三免，皮下注射，共计14个注射点。分别为颌下、背部皮下各2个点；前腹股沟皮下各2个点；后腹股沟皮下各3个点。四免：三免后第10天进行四免，免疫方式同三免。五免：四免后第10天进行五免，免疫方式同三免。
1.4 血清制备与血清效价测定
分别于三免、四免后7～8 d采静脉血5～10 mL进行血清分离，采用琼脂扩散法检测血清抗体效价，剩余血清 置于-20 ℃ 冰箱冻存，标注抗体效价。第5次免疫注射后第 7～10 天经抗体效价检测，若供血羊准备重复利用，则每只羊根据体质量采血280～320 mL；若供血羊不准备重复利用，则将所有血采完，根据羊的体质量一般可采血900～1 200 mL。将采得的全血放入容器内，38 ℃水浴中静置 1.5～2.0 h，使血清充分析出，取出置于4～5 ℃冰箱中保存過夜。
1.5 琼脂板配制
配制0.01 mol/L PBS液，配方为NaCl 4.25 g、磷酸氢二钠1.35 g、磷酸二氢钠0.195 g、蒸馏水500 mL混匀，pH 值74。取100 mL PBS液置于烧杯中，加入优质琼脂1 g，2%叠氮钠或1%硫柳汞1.0 mL，沸水中融化均匀，将已融化的琼脂趁热倒入平皿中，制成3 mm 厚的琼脂板，冷却后备用。
1.6 结果判定
分别设置标准阴性对照孔、标准阳性对照孔，在标准阳性对照孔与抗原孔之间出现明显的致密白色沉淀线，标准阴性孔不出现沉淀线的前提下，将被测孔与对照孔进行比对，以判定阴阳性。利用Excel软件记录数据，并进行相关分析。
2 结果与分析
2.1 血清的产出
从接种人ApoB抗原的羊体中，通过颈静脉采血10～20 mL，装于离心管中倾斜放置，放于38 ℃水浴箱中孵育 1.5～2.0 h，再放入4 ℃ 冰箱过夜。第2天在无菌操作台上操作，移液器吸取血清上清液，放于指形管中，在指形管标记人ApoB及日期成功获得人ApoB血清上清液。经离心沉淀分出血清，根据每批血清的抗体效价进行抗体标准浓度调整与稀释，分装后置于-20 ℃冰箱冷冻保存。
2.2 血清效价及检测效果
通过琼脂扩散法检测血清效价，结果表明，三免后，血清抗体效价为1 ∶26，四免时增长到1 ∶28，五免抗体效价为 1 ∶210，达到后续用于制备检测试剂盒或者其他医学用途的抗体水平（表1）。
2.3 抗体生成规律
如图1所示，以效价对log2作图，结果显示：四免后所采集抗人ApoB血清效价比三免提高2 个数量级（或更高），五免比四免提高2个数量级（或更高）。笔者认为，五免后7 d内抗体效价可能升幅不高，10～20 d左右抗体效价处于高平台期。
3 结论与讨论
联合检测载脂蛋白A 与载脂蛋白B（ApoB）对血脂的判断具有重要的临床价值[3-4]。由于ApoB在脂质组装、转运过程中起核心作用，ApoB基因的遗传变异可能帮助解释脂质水平与严重动脉粥样硬化、冠心病之间的关系。测定载脂蛋白及脂蛋白HDL、LDL对分析病理发生状态很有帮助。由此可见ApoB对于医学诊断及疾病治疗的重要性。目前生产大量抗血清，主要采用大型家畜，包括马、绵羊、山羊等，这类家畜寿命较长，容易管理，不必施行麻醉即可从颈静脉采集大量血液，故主要用于抗血清的商品化生产[6]。本试验的主要创新点在于免疫程序方面，常规的免疫程序中注射方式一般都为皮下注射，本试验中首免时将腹股沟的皮下调整为皮内注射，这样注射的好处是二免时淋巴结会肿大，方便进行淋巴结注射，淋巴结注射亦是本试验的创新点，淋巴结是重要的免疫器官，理论上抗体生成效率更高，本试验五免之后的抗体效价能达到210，达到预期水平，可用于后期的商业化生产，具有较高的经济收益。本试验需要免疫5次，抗体效价才能符合生产要求，一方面2种抗体效价检测方法不同，不具备可比性；另一方面推测免疫原本身在羊上不易产生高的效价，尚需进一步研究。
参考文献：
[1]Uchide T，Tohya Y，Onda K，et a1.Apolipoprotein B （apoB） concentrations in lipopmteins in cows [J]. Vet Med Sci，1997，59（8）：711-714.
[2]姜伟超，张德太，张 科，等. 糖尿病及急性冠状动脉综合征患者ApoB与ApoA1比值测定的临床意义[J]. 临床血液学杂志：输血与检验版，2013，26（6）：837-840.
[3]Hirata T，Fujioka M，Takahashi Ka，et al. ApoB C7623T polymorphism predicts risk for steroid-induced osteonecrosis of the femoral head after renal transplantation[J]. Journal of Orthopaedic Science，2007，12（3）：199-206.
[4]陈保生. 载脂蛋白的结构和功能与病毒病的预防和治疗[J]. 中国医学科学院学报，2007，29（3）：448-451.