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摘 要 目的:探讨贞芪酪蛋白肽(LACP)在体外抑制胶质C6细胞生长并诱导其调亡的作用。方法:采用不同浓度的LACP处理C6细胞,通过MTT法检测LACP对C6细胞生长增殖的抑制作用,流式细胞技术检测LACP作用后的细胞周期分布变化及诱导细胞凋亡情况。结果:LACP能抑制C6细胞的生长增殖,并呈时间浓度依赖性;同时LACP能影响C6细胞的细胞周期分布,使细胞阻滞于G1期;LACP可以诱导C6细胞发生调亡的改变。结论:LACP明显抑制C6细胞生长并诱导其发生凋亡和细胞周期改变。
关键词 贞芪酪蛋白肽 神经胶质瘤 C6细胞 凋亡
doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2010.15.149
资料与方法
材料:C6细胞系大鼠胶质母细胞瘤。LACP,纯度>99%,用二甲亚砜溶解,配成200mmol/L的储备液,-4℃保存。试验前用含10%小牛血清的1640培养液稀释成不同浓度。四甲基偶氮唑蓝(MTT),二甲亚砜(DMSO),流式细胞仪(XL)。
方法:①细胞培养:C6细胞接种于1640培养液培养,隔日用0.25%胰酶消化传代。②MTT法检测LACP对C6细胞作用的时效及量效关系取对数生长期C6细胞,按1×105/ml接种于96孔板内,分24、48、72小时三大组,各组细胞培养24小时。将培养液换成含不同浓度LACP的培养液,继续培养24、48、72小时后各取出一块培养板,观察细胞生长状态并拍照。随后检测490nm波长处的光密度(OD)值。③流式细胞仪检测细胞周期分布收集对数生长期C6细胞,接种于6孔板中,设4组,每组设复孔培养24小时后,将培养液换成含不同浓度LACP继续培养24小时。收集细胞,上流式细胞仪检测细胞周期。④流式细胞仪检测细胞凋亡收集对数生长期C6细胞,接种于6孔板中,设4组,每组设复孔,培养24小时将培养液换成含不同浓度LACP继续培养24小时,流式细胞仪进行检测,分析用药后细胞凋亡的百分比。
统计学处理:实验结果以均数±标准差表示,应用SPSS13.0统计软件分析,根据资料性质应用方差分析或t检验,检验水准α=0.05。
结 果
LACP作用于C6细胞后的倒置显微镜观察:不同浓度LACP作用于C6细胞24、48、72小时后,倒置显微镜下观察可见C6细胞随着时间的延长及浓度的增大,细胞失去了正常的贴壁生长状态,脱壁现象越加明显。细胞形态发生了明显变化,细胞变圆,细胞核固缩,核染色质致密,形状不一、大小不等的团块边集于核膜,最终可见坏死细胞增多。
LACP作用于C6细胞后的生长抑制试验在一定时间范围内,随着LACP浓度的增加,OD值相应减少。细胞的OD值与LACP浓度呈明显的负相关关系,24、48、72小时时OD值与LACP浓度负相关系数分别为-0.91、-0.92、-0.96。经多因素方差分析,LACP在不同浓度(P<0.05)、不同时间(P<0.05)对C6细胞的生长抑制也不同。见表1。
流式细胞仪检测细胞周期分布随LACP浓度的增加,C6细胞的G1期细胞明显增加,而S期比例减低(P<0.05),G2期比例变化范围不大(P>0.05),并且这种作用呈剂量依赖性,说明了LACP可引起C6细胞G1期阻滞。
流式细胞仪检测细胞凋亡:经流式细胞仪分别检测0、50、100及150mol/L浓度LACP作用于C6细胞24小时后凋亡细胞在总细胞数中所占比例分别为0.08%、0.30%、2.31%及18.26%。说明随着LACP浓度的增大,凋亡细胞明显增多,凋亡细胞在细胞总数中所占的比例增加。
讨 论
研究表明LACP对多种肿瘤均具有抑制作用[1]。肿瘤细胞的基本生物学特征为增殖与分化的平衡失调,恶性肿瘤细胞由正常细胞分化障碍、恶变而来,表现为失控的增殖和去分化,许多恶性肿瘤细胞分化程度差,呈现胚胎细胞特征[2]。LACP在肿瘤启动、促进及发展3个阶段都显示抗肿瘤功效。本实验显示随着LACP浓度的增加,它对C6细胞的抑制程度增大,细胞存活率减少。鉴于过度增殖是肿瘤细胞的一大特性,因而细胞周期与肿瘤的关系一直是生命科学研究中的热门课题[3]。我们的研究显示LACP可引起C6细胞G1期阻滞。细胞凋亡对于保持多细胞机体的完整性及动态平衡起重要作用。如果细胞凋亡受抑,结果细胞死亡率下降,则细胞数目不断增加,即表现出生长优势,这是肿瘤形成的一个重要基础。因而促进细胞凋亡对于肿瘤治疗以及抗增生性疾病等具有重要的意义。
本研究表明:LACP能抑制体外培养的C6细胞生长,这种作用呈时间浓度依耐性;LACP能使C6细胞周期阻滞于G1期,阻断细胞由G1期向S期的进程,而这种作用呈剂量依耐性;LACP可以诱导C6细胞发生凋亡的改变。LACP作为一种广泛存在于自然界的植物补体,已被证实具有较为肯定和广泛的抗肿瘤活性,是一种很有希望治疗脑胶质瘤的天然化学防癌剂和化学治疗药物。
参考文献
1 张延英,朱建坤,吴建军,等.贞芪酪蛋白肽药物血清诱导Bel-7402细胞分化的体外实验研究.中国实验方剂学杂志,2008,14(9):47-50.
2 杨建青,杨连粤.化疗诱导肺腺癌A549细胞凋亡中p53和bcl-2基因的调控.中华肝胆外科杂志,2001,7(1):31-33.
3 花宝金.中药有效单体对肿瘤细胞诱导分化及凋亡的机制研究.中国中医基础医学杂志,2002,8(7):63-65.
关键词 贞芪酪蛋白肽 神经胶质瘤 C6细胞 凋亡
doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2010.15.149
资料与方法
材料:C6细胞系大鼠胶质母细胞瘤。LACP,纯度>99%,用二甲亚砜溶解,配成200mmol/L的储备液,-4℃保存。试验前用含10%小牛血清的1640培养液稀释成不同浓度。四甲基偶氮唑蓝(MTT),二甲亚砜(DMSO),流式细胞仪(XL)。
方法:①细胞培养:C6细胞接种于1640培养液培养,隔日用0.25%胰酶消化传代。②MTT法检测LACP对C6细胞作用的时效及量效关系取对数生长期C6细胞,按1×105/ml接种于96孔板内,分24、48、72小时三大组,各组细胞培养24小时。将培养液换成含不同浓度LACP的培养液,继续培养24、48、72小时后各取出一块培养板,观察细胞生长状态并拍照。随后检测490nm波长处的光密度(OD)值。③流式细胞仪检测细胞周期分布收集对数生长期C6细胞,接种于6孔板中,设4组,每组设复孔培养24小时后,将培养液换成含不同浓度LACP继续培养24小时。收集细胞,上流式细胞仪检测细胞周期。④流式细胞仪检测细胞凋亡收集对数生长期C6细胞,接种于6孔板中,设4组,每组设复孔,培养24小时将培养液换成含不同浓度LACP继续培养24小时,流式细胞仪进行检测,分析用药后细胞凋亡的百分比。
统计学处理:实验结果以均数±标准差表示,应用SPSS13.0统计软件分析,根据资料性质应用方差分析或t检验,检验水准α=0.05。
结 果
LACP作用于C6细胞后的倒置显微镜观察:不同浓度LACP作用于C6细胞24、48、72小时后,倒置显微镜下观察可见C6细胞随着时间的延长及浓度的增大,细胞失去了正常的贴壁生长状态,脱壁现象越加明显。细胞形态发生了明显变化,细胞变圆,细胞核固缩,核染色质致密,形状不一、大小不等的团块边集于核膜,最终可见坏死细胞增多。
LACP作用于C6细胞后的生长抑制试验在一定时间范围内,随着LACP浓度的增加,OD值相应减少。细胞的OD值与LACP浓度呈明显的负相关关系,24、48、72小时时OD值与LACP浓度负相关系数分别为-0.91、-0.92、-0.96。经多因素方差分析,LACP在不同浓度(P<0.05)、不同时间(P<0.05)对C6细胞的生长抑制也不同。见表1。
流式细胞仪检测细胞周期分布随LACP浓度的增加,C6细胞的G1期细胞明显增加,而S期比例减低(P<0.05),G2期比例变化范围不大(P>0.05),并且这种作用呈剂量依赖性,说明了LACP可引起C6细胞G1期阻滞。
流式细胞仪检测细胞凋亡:经流式细胞仪分别检测0、50、100及150mol/L浓度LACP作用于C6细胞24小时后凋亡细胞在总细胞数中所占比例分别为0.08%、0.30%、2.31%及18.26%。说明随着LACP浓度的增大,凋亡细胞明显增多,凋亡细胞在细胞总数中所占的比例增加。
讨 论
研究表明LACP对多种肿瘤均具有抑制作用[1]。肿瘤细胞的基本生物学特征为增殖与分化的平衡失调,恶性肿瘤细胞由正常细胞分化障碍、恶变而来,表现为失控的增殖和去分化,许多恶性肿瘤细胞分化程度差,呈现胚胎细胞特征[2]。LACP在肿瘤启动、促进及发展3个阶段都显示抗肿瘤功效。本实验显示随着LACP浓度的增加,它对C6细胞的抑制程度增大,细胞存活率减少。鉴于过度增殖是肿瘤细胞的一大特性,因而细胞周期与肿瘤的关系一直是生命科学研究中的热门课题[3]。我们的研究显示LACP可引起C6细胞G1期阻滞。细胞凋亡对于保持多细胞机体的完整性及动态平衡起重要作用。如果细胞凋亡受抑,结果细胞死亡率下降,则细胞数目不断增加,即表现出生长优势,这是肿瘤形成的一个重要基础。因而促进细胞凋亡对于肿瘤治疗以及抗增生性疾病等具有重要的意义。
本研究表明:LACP能抑制体外培养的C6细胞生长,这种作用呈时间浓度依耐性;LACP能使C6细胞周期阻滞于G1期,阻断细胞由G1期向S期的进程,而这种作用呈剂量依耐性;LACP可以诱导C6细胞发生凋亡的改变。LACP作为一种广泛存在于自然界的植物补体,已被证实具有较为肯定和广泛的抗肿瘤活性,是一种很有希望治疗脑胶质瘤的天然化学防癌剂和化学治疗药物。
参考文献
1 张延英,朱建坤,吴建军,等.贞芪酪蛋白肽药物血清诱导Bel-7402细胞分化的体外实验研究.中国实验方剂学杂志,2008,14(9):47-50.
2 杨建青,杨连粤.化疗诱导肺腺癌A549细胞凋亡中p53和bcl-2基因的调控.中华肝胆外科杂志,2001,7(1):31-33.
3 花宝金.中药有效单体对肿瘤细胞诱导分化及凋亡的机制研究.中国中医基础医学杂志,2002,8(7):63-65.