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摘 要：建立了气相色谱外标法与内标法检测米糠脂肪烷醇中高级脂肪烷醇的含量，并对两种方法进行了比较。外标法中，样品经甲苯30 ℃超声提取，采用HP-5色谱柱（30 m×0.320 mm×0.25 μm）分离，用标准曲线测定含量;内标法中，样品经甲苯提取后，加入一定浓度的邻苯二甲酸二葵酯作为内标物，用标准曲线内标法测定。结果表明，在0.01～0.20 mg/mL
范围内，两种方法中2种目标化合物都呈良好的线性关系，相关系数（r2）大于0.99，检出限（S/N=3）和定量限（S/N=10）分别为0.07%、0.08%和0.20%、0.25%;3个加标水平下，米糠脂肪烷醇中二十八烷醇和三十烷醇的平均加标回收率为95.8%～104.0%，相对标准偏差（RSD）为0.769%～3.240%（n=6）。两种方法简单、高效、准确，可为米糠脂肪烷醇中高级脂肪烷醇检测标准的建立提供参考。
关键词：气相色谱法;二十八烷醇;三十烷醇;高级脂肪烷醇;米糠脂肪烷醇
米糠脂肪烷醇是2017年卫计委发布的一种新食品原料。有研究表明，米糠脂肪烷醇对于在改善身体状态以及保健等多方面具有良好的功效，目前已被应用于各种功能性食品[1]或保健食品中。
米糠脂肪烷醇主要来源于米糠，是以米糠为原料制得米糠蜡，经皂化、提取、过滤等工艺制成的十二个碳原子以上蜡状固体的饱和一元醇[2]。其性状为白色到浅黄色粉末，无味，对光、热稳定，主要成分为二十八碳脂肪烷醇、三十碳脂肪烷醇、三十二碳脂肪烷醇。一般以二十八碳脂肪烷醇、三十碳脂肪烷醇含量之和计。
目前国内外研究证实，二十八烷醇是一种天然的抗疲劳物质，在增强耐力、精力和体力[3-4];调节运动神经功能[5-6];
增强登高运动机能[7-8];保护肝脏作用[9-10];改善新陈代谢比率[11-13]，降低胆固醇[14]、血脂[15-16]，抗凝血[17]等方面有着明显的作用。而三十烷醇作为新型的天然植物生长剂，证实不仅对植物生长具有调节和促进作用，还具有明显的增产效果[18-20]。现国内已有多家利用米糠蜡制备二十八烷醇和三十烷醇的企业，但目前还没有相对应的国家检测标准，这导致企业无法向购买者提供检定证书，影响销售，同时也造成监管方面存在缺口。
本文采用火焰离子化检测器检测，建立了米糠脂肪烷醇中高级脂肪烷醇的气相色谱外标和内标两种检测方法，旨在为国家制定米糠脂肪烷醇中高级脂肪烷醇含量测定和风险监测、评估提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 仪器、试剂与材料
7890A气相色谱仪，配火焰离子化检测器（FID）（美国Agilent公司）;2500TH数控超声波清洗器（上海安谱实验科技股份有限公司）。二十八烷醇（纯度97.4%，BePure）;三十烷醇（纯度98.5%，BePure）;邻苯二甲酸二葵酯（纯度95%，阿拉丁）;甲苯（HPLC级，德国CNW科技公司）;准确称取20 mg二十八烷醇和三十烷醇标准品（精确至0.01 mg）
于100 mL容量瓶中，用甲苯配制成质量浓度为0.2 mg/mL
的标准混合储备液，常温密封保存，备用;确称取50 mg邻苯二甲酸二葵酯标准溶液，用甲苯配制成5 mg/mL的内标工作液，冷藏保存。
1.2 样品前处理
1.2.1 提取
外标法：称取20 mg米糠脂肪烷醇样品，置于100 mL容量瓶中，加入80 mL甲苯，30 ℃超声提取5 min，使其完全溶解，静置至室温后用甲苯定容至100 mL，滤液供气相色谱仪测定。
内标法：称取20 mg米糠脂肪烷醇样品，置于100 mL容量瓶中，加入80 mL甲苯，30 ℃超声提取5 min，使其完全溶解，静置至室温后用甲苯定容至100 mL，取1 mL滤液，加入40 μL内标液，混匀，供气相色谱仪测定。
1.2.2 色谱条件
色谱柱：HP-5柱（30 m×0.320 mm×0.25 μm，美国Agilent公司）;进样口温度：300 ℃;检测器（FID）温度：320 ℃;程序升温：初始温度为200 ℃，保存1 min，以10 ℃/min的速率升至300 ℃，保存20 min;进样方式：不分流进样;进样量：2 μL;载气：高纯氮气（纯度为99.999%）;恒定流速：1 mL/min。二十八烷醇的保留时间为13.426 min，三十烷醇的保留时间为15.722 min。二十八烷醇和三十烷醇的标准溶液色谱图见图1。
1.3 计算方法
两种方法都直接采用标准曲线定量的方式进行计算。
2 结果与分析
2.1 检测方法的探讨
红外光谱可以表征羟基（-OH）、末端甲基（-CH3）、次甲基（-CH2）以及（-CH2-）n特有的吸收峰，证明含有饱和碳直链的伯醇，但二十八烷醇和三十烷醇是同系物，都有类似的吸收峰，故还需要结合质谱分析，测其分子离子峰，以及主要特征碎片，证明有没有侧鏈，确定其分子量。而二十八烷醇和三十烷醇在紫外光谱中，特征吸收波长分别在198 nm和200 nm处[21]，非常接近，因而采用紫外检测器对其定量不可行。由于二十八烷醇和三十烷醇的热稳定性好，因此采用气相色谱法分析会是最经济简便、有效可靠的方法。
2.2 色谱条件的选择
2.2.1 色谱柱的选择
色谱柱的选择对样品的分离十分重要，通常不同类型的填料对同一样品有不同的保留效果。HP-5色谱柱是高性能通用色谱柱，其应用范围广，温度上限高。根据二十八烷醇和三十烷醇的弱极性，以及柱子对高温的耐受性，采用HP-5色谱柱时，二十八烷醇和三十烷醇能较好的保留和分离，且响应值高。
2.2.2 仪器条件的选择 二十八烷醇和三十烷醇属于同系物，在气相色谱分析中，对于组分沸点范围窄、化学性质类似的样品，一般选用一价升温。另外二十八烷醇和三十烷醇都属于高沸点物质，实验发现，在初始温度为200 ℃，保存1 min，以10 ℃/min的速率升至300 ℃，保存20 min时，两者可以得到很好的分离。
2.3 提取条件的选择
2.3.1 提取试剂的筛选
米糠脂肪烷醇不溶于水，对酸、碱、还原剂稳定，但能溶于热乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、甲苯、环己烷、正己烷、异丙醇、石油醚（60-90）、甲醇、丙酮等有机溶剂。本文重点比较了10种有机试剂对于米糠脂肪烷醇的溶解情况，以及从峰面积比较其提取效果。不同提取溶剂对米糠脂肪烷醇的溶解情况见表1，提取效果见图2。实验发现，乙醇、甲醇和丙酮作为溶剂时，米糠脂肪烷醇的溶解效果最差，响应值最低;环己烷、正己烷、异丙醇和石油醚（60-90）作为溶剂时，响应值高，但对于米糠脂肪烷醇的溶解度低，对温度要求高，溶解后更容易析出;三氯甲烷、甲苯和二氯甲烷作为溶剂时，米糠脂肪烷醇的溶解速度快，虽然三氯甲烷作为溶剂溶解效果最好，但响应值偏低，二氯甲烷的响应值更低，而甲苯作为溶剂时溶解度比三氯甲烷低，但响应值高。另外根据《中华人民共和国药典2005版》中溶剂毒性分类，三氯甲烷、甲苯和二氯甲烷都属于二类溶剂，但从每日允许接触量看，毒性：三氯甲烷>二氯甲烷>甲苯。从毒理学资料分析，三氯甲烷属中等毒性，具有强麻醉性，而且在人体内不能被肝脏代谢，毒性最大;甲苯和二氯甲烷差不多，属低毒类，但甲苯很不活泼，在人体温度下不与人体蛋白质、酶、氨基酸等活性物质反应，大部分可在体内被代谢;而二氯甲烷则不同，它是卤代烃，很容易与人体内蛋白质、酶、氨基酸等发生反应而产生致癌物质。因此，最终确定提取溶剂为甲苯。
2.3.2 提取条件的优化
考虑到米糠脂肪烷醇中二十八烷醇和三十烷醇的含量各不同，为确定含量对溶解效果的影响，采用甲苯对含量为10%、30%、50%、70%和90%的二十八烷醇和三十烷醇的米糠脂肪烷醇样品进行提取比较。实验发现，称样量相同的样品中二十八烷醇和三十烷醇的含量多少对样品的溶解速度影响不大。根据温度对样品的溶解速度的影响，温度越高，溶解度越大，饱和度越高，为进一步优化提取效果，采用不同温度、不同超声时间对不同纯度样品进行提取。研究发现，在水温30 ℃超声提取，甲苯对样品的溶解速度比其在常温20 ℃超声提取快，30 ℃超声提取5 min，样品完全溶解，相当于20 ℃超声提取25 min;而30 ℃以上的超声提取效果都差不多，考虑到超声提取后要静置至常温再定容，所以水温30 ℃超声提取较为适宜。另外研究发现，样品称样量越大，在低温（2～8 ℃）静置一段时间，溶解后的样品晶体析出越多，特别是三十烷醇的含量越高，越容易析出，恢复至25 ℃一段时间后会复溶。因此，最终的提取条件定为称取样品0.02 g，水浴30 ℃超声提取5 min。
2.4 线性方程、检出限和定量限
外标法：配制质量浓度为0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.05 mg/mL、0.10 mg/mL和0.20mg/mL的二十八烷醇和三十烷醇混合标准工作溶液，在选定的色谱条件下进行测定。以目标组分峰面积（y）为纵坐标，以其对应的质量浓度（x，mg/mL）为横坐标作线性回归分析（见表2）。内标法：配制与外标法同样浓度的混合标准工作液，在1 mL系列浓度中分别加入40 μL邻苯二甲酸二葵酯内标工作液，以目标组分跟内标物的峰面积比y为纵坐标，以系列浓度（x，mg/mL）为横坐标作线性回归分析（见表2）。结果表明，两种方法中2种目标化合物在各自的线性范围内线性关系良好，相关系数（r2）均大于0.99。根据1.2.2的色谱条件，将1.1中的标准混合储备液逐步稀释浓度，以3倍和10倍信噪比（S/N）为检出限（LOD）和定量限（LOQ），二十八烷醇和三十烷醇的检出限分别为0.07%和0.08%，定量限分别为0.2%和0.25%（见表2）。
2.5 回收率和精密度
向样品中分别加入基本等量、2倍等量和10倍等量3个水平的二十八烷醇和三十烷醇标准溶液，按所建立的方法进行测定。每份样品进行6次平行测定，考察方法的回收率和精密度。由表3可知，两种方法中二十八烷醇和三十烷醇的平均回收率为95.8%～104.0%，相对标准偏差（RSD）为0.769%～3.24%，说明外标法和内标法都具有较好的可靠性。
3 结论
本文建立了高效的气相色谱外标法和内标法检测米糠脂肪烷醇中高级脂肪烷醇的含量。外标法更简便，但对仪器的要求高，内标法可减少仪器误差，两种方法都具有简单高效，灵敏度高，分析速度快的特点。可为国家风险监测、风险评估提供技术支持，为制定米糠脂肪烷醇的检测标准奠定基础。
参考文献
[1]李金岭.米糠脂肪烷醇及其在运动饮料中的应用展望[J].粮食与饲料工业，2018（2）：12-12.
[2]陈宏艳.从米糠蜡提取分離高级脂肪醇的研究[D].杭州：浙江大学，2003.
[3]徐韵扬.米糠蜡中二十八烷醇和三十烷醇的制备研究[D].武汉：武汉轻工大学，2014.
[4]董艳国，仇梓冰.二十八烷醇缓解小鼠体力疲劳的作用[J].中国生物制品学杂志，2017，30（4）：386-389.
[5]曹志然，李利平，徐月清.二十八烷醇对实验动物免疫功能及游泳耐力的影响[J].食品科学，2004（7）：158-160.
[6]曹强.二十八烷醇在运动糖果中的应用[J].食品科学，1988（10）：37-39.
[7]李少英.服用二十八烷醇对自行车运动员免疫功能的影响[D].济南：山东师范大学，2007. [8]刘福玉，周其全，崔建华，等.二十八烷醇增强高原军事作业能力的现场实验研究[J].西南国防医药，2009，19（7）：670-671.
[9]RAO K S，MISHRA S H.In vitro assessment of antihepetotoxic activity of n-octacosan01[J].India J Pham Sci，1997，59（6）：292-294.
[10]YOSHIJI 0，EMI SISAO I.Effect of oral octacosanol administration on hepatic triglyceride accumulation in rats with carbon tetraehlofide induced acute liver injury[J].Igaku to Seibutsugaku，1997，134（6）：185-189.
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范围内，两种方法中2种目标化合物都呈良好的线性关系，相关系数（r2）大于0.99，检出限（S/N=3）和定量限（S/N=10）分别为0.07%、0.08%和0.20%、0.25%;3个加标水平下，米糠脂肪烷醇中二十八烷醇和三十烷醇的平均加标回收率为95.8%～104.0%，相对标准偏差（RSD）为0.769%～3.240%（n=6）。两种方法简单、高效、准确，可为米糠脂肪烷醇中高级脂肪烷醇检测标准的建立提供参考。
关键词：气相色谱法;二十八烷醇;三十烷醇;高级脂肪烷醇;米糠脂肪烷醇
米糠脂肪烷醇是2017年卫计委发布的一种新食品原料。有研究表明，米糠脂肪烷醇对于在改善身体状态以及保健等多方面具有良好的功效，目前已被应用于各种功能性食品[1]或保健食品中。
米糠脂肪烷醇主要来源于米糠，是以米糠为原料制得米糠蜡，经皂化、提取、过滤等工艺制成的十二个碳原子以上蜡状固体的饱和一元醇[2]。其性状为白色到浅黄色粉末，无味，对光、热稳定，主要成分为二十八碳脂肪烷醇、三十碳脂肪烷醇、三十二碳脂肪烷醇。一般以二十八碳脂肪烷醇、三十碳脂肪烷醇含量之和计。
目前国内外研究证实，二十八烷醇是一种天然的抗疲劳物质，在增强耐力、精力和体力[3-4];调节运动神经功能[5-6];
增强登高运动机能[7-8];保护肝脏作用[9-10];改善新陈代谢比率[11-13]，降低胆固醇[14]、血脂[15-16]，抗凝血[17]等方面有着明显的作用。而三十烷醇作为新型的天然植物生长剂，证实不仅对植物生长具有调节和促进作用，还具有明显的增产效果[18-20]。现国内已有多家利用米糠蜡制备二十八烷醇和三十烷醇的企业，但目前还没有相对应的国家检测标准，这导致企业无法向购买者提供检定证书，影响销售，同时也造成监管方面存在缺口。
本文采用火焰离子化检测器检测，建立了米糠脂肪烷醇中高级脂肪烷醇的气相色谱外标和内标两种检测方法，旨在为国家制定米糠脂肪烷醇中高级脂肪烷醇含量测定和风险监测、评估提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 仪器、试剂与材料
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的标准混合储备液，常温密封保存，备用;确称取50 mg邻苯二甲酸二葵酯标准溶液，用甲苯配制成5 mg/mL的内标工作液，冷藏保存。
1.2 样品前处理
1.2.1 提取
外标法：称取20 mg米糠脂肪烷醇样品，置于100 mL容量瓶中，加入80 mL甲苯，30 ℃超声提取5 min，使其完全溶解，静置至室温后用甲苯定容至100 mL，滤液供气相色谱仪测定。
内标法：称取20 mg米糠脂肪烷醇样品，置于100 mL容量瓶中，加入80 mL甲苯，30 ℃超声提取5 min，使其完全溶解，静置至室温后用甲苯定容至100 mL，取1 mL滤液，加入40 μL内标液，混匀，供气相色谱仪测定。
1.2.2 色谱条件
色谱柱：HP-5柱（30 m×0.320 mm×0.25 μm，美国Agilent公司）;进样口温度：300 ℃;检测器（FID）温度：320 ℃;程序升温：初始温度为200 ℃，保存1 min，以10 ℃/min的速率升至300 ℃，保存20 min;进样方式：不分流进样;进样量：2 μL;载气：高纯氮气（纯度为99.999%）;恒定流速：1 mL/min。二十八烷醇的保留时间为13.426 min，三十烷醇的保留时间为15.722 min。二十八烷醇和三十烷醇的标准溶液色谱图见图1。
1.3 计算方法
两种方法都直接采用标准曲线定量的方式进行计算。
2 结果与分析
2.1 检测方法的探讨
红外光谱可以表征羟基（-OH）、末端甲基（-CH3）、次甲基（-CH2）以及（-CH2-）n特有的吸收峰，证明含有饱和碳直链的伯醇，但二十八烷醇和三十烷醇是同系物，都有类似的吸收峰，故还需要结合质谱分析，测其分子离子峰，以及主要特征碎片，证明有没有侧鏈，确定其分子量。而二十八烷醇和三十烷醇在紫外光谱中，特征吸收波长分别在198 nm和200 nm处[21]，非常接近，因而采用紫外检测器对其定量不可行。由于二十八烷醇和三十烷醇的热稳定性好，因此采用气相色谱法分析会是最经济简便、有效可靠的方法。
2.2 色谱条件的选择
2.2.1 色谱柱的选择
色谱柱的选择对样品的分离十分重要，通常不同类型的填料对同一样品有不同的保留效果。HP-5色谱柱是高性能通用色谱柱，其应用范围广，温度上限高。根据二十八烷醇和三十烷醇的弱极性，以及柱子对高温的耐受性，采用HP-5色谱柱时，二十八烷醇和三十烷醇能较好的保留和分离，且响应值高。
2.2.2 仪器条件的选择 二十八烷醇和三十烷醇属于同系物，在气相色谱分析中，对于组分沸点范围窄、化学性质类似的样品，一般选用一价升温。另外二十八烷醇和三十烷醇都属于高沸点物质，实验发现，在初始温度为200 ℃，保存1 min，以10 ℃/min的速率升至300 ℃，保存20 min时，两者可以得到很好的分离。
2.3 提取条件的选择
2.3.1 提取试剂的筛选
米糠脂肪烷醇不溶于水，对酸、碱、还原剂稳定，但能溶于热乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、甲苯、环己烷、正己烷、异丙醇、石油醚（60-90）、甲醇、丙酮等有机溶剂。本文重点比较了10种有机试剂对于米糠脂肪烷醇的溶解情况，以及从峰面积比较其提取效果。不同提取溶剂对米糠脂肪烷醇的溶解情况见表1，提取效果见图2。实验发现，乙醇、甲醇和丙酮作为溶剂时，米糠脂肪烷醇的溶解效果最差，响应值最低;环己烷、正己烷、异丙醇和石油醚（60-90）作为溶剂时，响应值高，但对于米糠脂肪烷醇的溶解度低，对温度要求高，溶解后更容易析出;三氯甲烷、甲苯和二氯甲烷作为溶剂时，米糠脂肪烷醇的溶解速度快，虽然三氯甲烷作为溶剂溶解效果最好，但响应值偏低，二氯甲烷的响应值更低，而甲苯作为溶剂时溶解度比三氯甲烷低，但响应值高。另外根据《中华人民共和国药典2005版》中溶剂毒性分类，三氯甲烷、甲苯和二氯甲烷都属于二类溶剂，但从每日允许接触量看，毒性：三氯甲烷>二氯甲烷>甲苯。从毒理学资料分析，三氯甲烷属中等毒性，具有强麻醉性，而且在人体内不能被肝脏代谢，毒性最大;甲苯和二氯甲烷差不多，属低毒类，但甲苯很不活泼，在人体温度下不与人体蛋白质、酶、氨基酸等活性物质反应，大部分可在体内被代谢;而二氯甲烷则不同，它是卤代烃，很容易与人体内蛋白质、酶、氨基酸等发生反应而产生致癌物质。因此，最终确定提取溶剂为甲苯。
2.3.2 提取条件的优化
考虑到米糠脂肪烷醇中二十八烷醇和三十烷醇的含量各不同，为确定含量对溶解效果的影响，采用甲苯对含量为10%、30%、50%、70%和90%的二十八烷醇和三十烷醇的米糠脂肪烷醇样品进行提取比较。实验发现，称样量相同的样品中二十八烷醇和三十烷醇的含量多少对样品的溶解速度影响不大。根据温度对样品的溶解速度的影响，温度越高，溶解度越大，饱和度越高，为进一步优化提取效果，采用不同温度、不同超声时间对不同纯度样品进行提取。研究发现，在水温30 ℃超声提取，甲苯对样品的溶解速度比其在常温20 ℃超声提取快，30 ℃超声提取5 min，样品完全溶解，相当于20 ℃超声提取25 min;而30 ℃以上的超声提取效果都差不多，考虑到超声提取后要静置至常温再定容，所以水温30 ℃超声提取较为适宜。另外研究发现，样品称样量越大，在低温（2～8 ℃）静置一段时间，溶解后的样品晶体析出越多，特别是三十烷醇的含量越高，越容易析出，恢复至25 ℃一段时间后会复溶。因此，最终的提取条件定为称取样品0.02 g，水浴30 ℃超声提取5 min。
2.4 线性方程、检出限和定量限
外标法：配制质量浓度为0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.05 mg/mL、0.10 mg/mL和0.20mg/mL的二十八烷醇和三十烷醇混合标准工作溶液，在选定的色谱条件下进行测定。以目标组分峰面积（y）为纵坐标，以其对应的质量浓度（x，mg/mL）为横坐标作线性回归分析（见表2）。内标法：配制与外标法同样浓度的混合标准工作液，在1 mL系列浓度中分别加入40 μL邻苯二甲酸二葵酯内标工作液，以目标组分跟内标物的峰面积比y为纵坐标，以系列浓度（x，mg/mL）为横坐标作线性回归分析（见表2）。结果表明，两种方法中2种目标化合物在各自的线性范围内线性关系良好，相关系数（r2）均大于0.99。根据1.2.2的色谱条件，将1.1中的标准混合储备液逐步稀释浓度，以3倍和10倍信噪比（S/N）为检出限（LOD）和定量限（LOQ），二十八烷醇和三十烷醇的检出限分别为0.07%和0.08%，定量限分别为0.2%和0.25%（见表2）。
2.5 回收率和精密度
向样品中分别加入基本等量、2倍等量和10倍等量3个水平的二十八烷醇和三十烷醇标准溶液，按所建立的方法进行测定。每份样品进行6次平行测定，考察方法的回收率和精密度。由表3可知，两种方法中二十八烷醇和三十烷醇的平均回收率为95.8%～104.0%，相对标准偏差（RSD）为0.769%～3.24%，说明外标法和内标法都具有较好的可靠性。
3 结论
本文建立了高效的气相色谱外标法和内标法检测米糠脂肪烷醇中高级脂肪烷醇的含量。外标法更简便，但对仪器的要求高，内标法可减少仪器误差，两种方法都具有简单高效，灵敏度高，分析速度快的特点。可为国家风险监测、风险评估提供技术支持，为制定米糠脂肪烷醇的检测标准奠定基础。
参考文献
[1]李金岭.米糠脂肪烷醇及其在运动饮料中的应用展望[J].粮食与饲料工业，2018（2）：12-12.
[2]陈宏艳.从米糠蜡提取分離高级脂肪醇的研究[D].杭州：浙江大学，2003.
[3]徐韵扬.米糠蜡中二十八烷醇和三十烷醇的制备研究[D].武汉：武汉轻工大学，2014.
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