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摘 要 采用TTC法和联苯胺-过氧化氢法测定了野豌豆属5个亚种植物的花粉活力和柱头可授性，结果表明：野豌豆属5个亚种植物在花瓣未展开时均具有较高的花粉活力和柱头可授性，随着散粉时间的延长，野豌豆属5个亚种植物的花粉活力呈现逐渐降低的趋势;散粉初期花粉活力最低的是Vicia sativa亚种中的2号，平均为77.3%。
关键词 野豌豆属;花粉活力;柱头可授性;杂交育种
中图分类号：S542+.3 文献标志码：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2021.28.005
野豌豆属（Vicia）牧草为一年生或多年生豆科植物，多具有直立茎、蔓生或卷须攀援特性，在我国主要种植于长江中下游、西北及华北诸省区，该属植物可用作优良牧草、绿肥及农田覆盖作物，较广的适应性和优良的经济价值使其在我国农牧业系统中发挥了重要的作用[1-2]。该属植物在全球划分有190余个物种[3]，Ball等将其主要划分为Vicia、Cracca、Ervum和Faba 4个亚属[4];Maxted等则在原始的表型基础上又进一步分类，将Vicia亚属更为细致地划分成9个大系列，38个种，14个亚种[5]。在我国分布的本属植物共有43种，其中划分了4个变种，6个变型[2]。该属植物大多为闭花授粉，当前杂交育种是对其进行品种选育的主要手段。但由于该属植物花蕾较小，在自然授粉条件下龙骨瓣會发生闭合现象，从而导致人工授粉时去雄和授粉费时费力[6]。在自然界，植物性繁殖过程中，两性间的传粉是繁殖的基础，授粉的花粉粒必须在其具有较强活力时到达适宜的接受柱头。因此，花粉粒的活性与柱头的可授性是杂交育种中必不可少的研究内容[7]。目前，对野豌豆属植物的花粉活力及柱头可授性等方面的研究报道较少。本文研究野豌豆属5个亚种植物花粉活力及柱头可授性，旨在为野豌豆属植物的有性繁殖特性，为种内和种间人工杂交育种研究提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
研究材料由美国种植资源库（NPGS）提供，对照材料为兰箭1号、兰箭3号，由国家农业农村部牧草与草坪草种子质量监督检验实验中心提供（见表1）。所有24个种质均于2014年4月26日种植在兰州大学草地农业科技学院榆中实验站。
1.2 花粉活力测定
使用TTC法测定花粉的活力和寿命[8]。具体方法是：于植物盛花期清晨8—9时分别采摘花瓣未展开和完全展开的新鲜花朵，将其花粉分别撒于载玻片上，滴加浓度为0.5%的TTC溶液，立即覆盖盖玻片，将制备好的载玻片放置于底部垫有湿润滤纸的玻璃培养皿中，将培养皿置于37 ℃黑暗条件下孵育1 h，取出后立即置于电子显微镜下镜检观测，统计载玻片中央3～5个视野中染色成功的花粉所占比例（经TTC溶液染色后，植物花粉活力强的呈现红色，色泽淡红的活力次之，呈现无色的为无活力花粉）。每种植物材料均在田间随机选取30朵小花进行测定，计算其花粉活力并对数据进行统计分析。
花粉活力=染色花粉数/观察总花粉数×100%
1.3 柱头可授性检测
采用联苯胺-过氧化氢法测定花的柱头可授性[8]。于植物盛花期清晨8—9时分别采摘花瓣未展开和完全展开的花朵，将其（每种随机选取30个）柱头剪下后放入凹面载玻片中，滴入配置好的反应液（1%联苯胺、3%过氧化氢、水的体积比为4∶11∶22）。若花的柱头具备可授性，则柱头和其附近接触的反应液呈蓝色并伴随有大量气泡出现;反之，则表明相应的花柱头无可授性或可授性较低。
1.4 统计分析
本研究采用ANOVA（单因素方差分析）对数据进行方差分析，使用Microsoft Excel 16.0和SPSS 20.0软件进行数据处理。
2 结果与分析
2.1 花粉活力检测结果
植物花粉有无活力及花粉活力的高低会对雌蕊授粉成功率产生显著的影响。经检测，野豌豆属5个亚种植物的花粉活力在花瓣未展开和完全展开后表现出显著的差异，当花瓣未展开时，其花粉活力表现为77.3%～99.5%，而当花瓣完全展开后，花粉活力表现为63.4%～89.4%。其中，4、6、11、12、15、17、20、21、23和24号种质花粉活力在花瓣未展开时较高，均达99%以上;最低的为2号种质，仅为77.3%。而当花瓣完全展开后，所有种质的花粉活力均呈现出不同程度的下降趋势。其中，1、4、5、6、13、14、16、17、18、23和24号种质花粉活力仍能保持在85%以上，2号和11号种质完全展开后花粉活力均在80%以下，分别为63.4%和79.5%（见表2），11号种质花粉活力下降最快。表明野豌豆属植物花粉活力随着散粉时间的延长呈现降低的趋势，且降低幅度在不同亚种间及同一亚种的不同种质间存在显著差异。
2.2 柱头可授性检测结果
柱头可授性检测结果见表3。结果显示，5个野豌豆属亚种植物的柱头在花瓣未展开时便具有柱头可授性，且在花瓣展开后柱头可授性与未展开时相比基本无变化。其中，2、3、4、6、13、14、15、16、17、18、21、23和24号种质柱头可授性较强;8、10和22号种质在花瓣未展开时和完全展开后均显示仅具有可授性，表明这3份种质材料的柱头结合能力较其他种质弱;全部种质中只有2号种质的柱头可授性在花瓣完全展开后呈现出降低的趋势。表明野豌豆属植物柱头可授性的持续时间较长，且不同亚种间及同一亚种的不同种质间存在差异。
3 讨论
花粉活力是指植物产生的雄配子体在其花粉管中进行生长的能力[9]。植物花粉活力的强弱、保持活力的持续时间及授粉柱头的可授性均具有较大的差异，一是由于植物物种不同而产生的差异，二是不同的环境因素也会对这些性状产生较强的影响[7]。如血盆草（Salvia cavaleriei Levl. var. simplicifolia Stib.），其花粉在长达7 d时间内均可存在较强的活力。自然条件下，百日菊（Zinnia elegans Jacq.）在天气晴朗的上午采集的花粉活力要显著高于下午采集的花粉[10]。而本研究中，野豌豆属5个亚种植物的花粉活力在花瓣未展开时与完全展开后相比出现了较大幅度的降低，表明其花粉活力持续时间较短，开花后花粉活力会随着时间的延长而降低。因此，在后期杂交选育时应选取花瓣未展开的花朵进行，有利于提高授粉的成功率。同时，花粉活力检测结果表明24个种质花粉全部都具备了活力，但花粉染色的程度存在一定的区别，其中7、8、10、12、15号种质的花粉染色程度较浅，其花粉育性（受精的能力）的大小还需进一步的实验加以验证。 柱头可授期是植物的花朵在成熟过程中一个十分重要的时期，其在较大程度上影响了不同植物的自花传粉率及植物不同开花阶段的传粉成功率等[11]。不同植物柱头的可授期具有较大的差异，其能够持续的时间可从几个小时延续到十几天不等，影响柱头可授期的主要因素是花的年龄，一天内的不同授粉时间及授粉柱头分泌物的有无等，这些因素对其均有显著影响[7]。野生芍药（Paeonia lactiflora Pall.）的柱头分泌黏液的时期大约是其花朵开花后的2 h，而其柱头的可授性可以从开花第一天一直持续到第五天[11]。本研究中，野豌豆属5个亚种植物的柱头可授性在花瓣未展开时同完全展开后相比大多数无显著性改变，只有2号种质出现了明显的下降，可见野豌豆属植物柱头可授性持续时间较长。
结合花粉活力和柱头可授性实验结果，表明野豌豆属植物花粉活力较易受开花时间和温度等因素影响，而柱頭可授性受到影响较小。因此，后期进行人工杂交时应尽量在晴朗的上午，选择花瓣未展开的花蕾。
4 结论
野豌豆属植物在全球分布广泛，且属内植物大多数具有较高的经济价值，是重要的农业种质资源。花粉活力和柱头可授性是作物杂交育种成败与否的关键指标之一，对作物新品种选育十分重要。本研究结果表明，5个亚种的野豌豆属植物花粉活力和柱头可授性均较高，随着散粉时间的延长，其花粉活力逐渐降低。这对野豌豆属植物进行人工育种时杂交时间的选择具有重要参考价值。
参考文献：
[1] 南志标，张吉宇，王彦荣，等.五个箭筈豌豆品系基因型与环境互作效应及农艺性状稳定性[J].生态学报，2004，24（3）：395-401.
[2] 夏振岱.中国野豌豆属的分类研究[J].植物分类学报，1996，34（4）：421-433.
[3] Castiglione M R，Gelati M T，Frediani M，et al. Cytology of Vicia species X. karyotype evolution and phylogenetic implication in Vicia species of the sections Atossa，Microcarinae，Wiggersia and Vicia[J]. Protoplasm，2011，248（4）：707-716.
[4] Ball P W，Tutin T G，Heywood V H，et al. Flora Europaea[M]. Cambridge：Cambridge University Press，1968.
[5] Maxted N. A phenetic investigation of Vicia L. subgenus Vicia （Leguminosae，Vicieae）[J]. Botanical Journal of the Linnean Society，1993，111（2）：155-182.
[6] 王敏.影响大豆杂交成活率因素初探[J].安徽农学通报，2009，15（4）：61-62.
[7] 母贵琴，张 利，钟国成，等. 鼠尾草属3种植物花粉活力与柱头可授性[J].四川农业大学学报，2011，29（2）：203-206.
[8] 钟国成，张利，杨瑞武，等.丹参及其近缘种花粉活力与柱头可授性研究[J].中国中药杂志，2010，35（6）：686-689.
[9] Atlagic J. Pollen fertility in some Helianthus L. species and their F1 hybrids with the cultivated sunflower[J]. Helia，1990，13（13）：41-47.
[10] 叶要妹，张俊卫，齐迎春，等.百日草柱头可授性和花粉生活力的研究[J].中国农业科学，2007，40（10）：2376-2381.
[11] 红雨，刘强，韩岚.芍药花粉活力和柱头可授性的研究[J].广西植物，2003，23（1）：90-92.
（责任编辑：丁志祥）
关键词 野豌豆属;花粉活力;柱头可授性;杂交育种
中图分类号：S542+.3 文献标志码：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2021.28.005
野豌豆属（Vicia）牧草为一年生或多年生豆科植物，多具有直立茎、蔓生或卷须攀援特性，在我国主要种植于长江中下游、西北及华北诸省区，该属植物可用作优良牧草、绿肥及农田覆盖作物，较广的适应性和优良的经济价值使其在我国农牧业系统中发挥了重要的作用[1-2]。该属植物在全球划分有190余个物种[3]，Ball等将其主要划分为Vicia、Cracca、Ervum和Faba 4个亚属[4];Maxted等则在原始的表型基础上又进一步分类，将Vicia亚属更为细致地划分成9个大系列，38个种，14个亚种[5]。在我国分布的本属植物共有43种，其中划分了4个变种，6个变型[2]。该属植物大多为闭花授粉，当前杂交育种是对其进行品种选育的主要手段。但由于该属植物花蕾较小，在自然授粉条件下龙骨瓣會发生闭合现象，从而导致人工授粉时去雄和授粉费时费力[6]。在自然界，植物性繁殖过程中，两性间的传粉是繁殖的基础，授粉的花粉粒必须在其具有较强活力时到达适宜的接受柱头。因此，花粉粒的活性与柱头的可授性是杂交育种中必不可少的研究内容[7]。目前，对野豌豆属植物的花粉活力及柱头可授性等方面的研究报道较少。本文研究野豌豆属5个亚种植物花粉活力及柱头可授性，旨在为野豌豆属植物的有性繁殖特性，为种内和种间人工杂交育种研究提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
研究材料由美国种植资源库（NPGS）提供，对照材料为兰箭1号、兰箭3号，由国家农业农村部牧草与草坪草种子质量监督检验实验中心提供（见表1）。所有24个种质均于2014年4月26日种植在兰州大学草地农业科技学院榆中实验站。
1.2 花粉活力测定
使用TTC法测定花粉的活力和寿命[8]。具体方法是：于植物盛花期清晨8—9时分别采摘花瓣未展开和完全展开的新鲜花朵，将其花粉分别撒于载玻片上，滴加浓度为0.5%的TTC溶液，立即覆盖盖玻片，将制备好的载玻片放置于底部垫有湿润滤纸的玻璃培养皿中，将培养皿置于37 ℃黑暗条件下孵育1 h，取出后立即置于电子显微镜下镜检观测，统计载玻片中央3～5个视野中染色成功的花粉所占比例（经TTC溶液染色后，植物花粉活力强的呈现红色，色泽淡红的活力次之，呈现无色的为无活力花粉）。每种植物材料均在田间随机选取30朵小花进行测定，计算其花粉活力并对数据进行统计分析。
花粉活力=染色花粉数/观察总花粉数×100%
1.3 柱头可授性检测
采用联苯胺-过氧化氢法测定花的柱头可授性[8]。于植物盛花期清晨8—9时分别采摘花瓣未展开和完全展开的花朵，将其（每种随机选取30个）柱头剪下后放入凹面载玻片中，滴入配置好的反应液（1%联苯胺、3%过氧化氢、水的体积比为4∶11∶22）。若花的柱头具备可授性，则柱头和其附近接触的反应液呈蓝色并伴随有大量气泡出现;反之，则表明相应的花柱头无可授性或可授性较低。
1.4 统计分析
本研究采用ANOVA（单因素方差分析）对数据进行方差分析，使用Microsoft Excel 16.0和SPSS 20.0软件进行数据处理。
2 结果与分析
2.1 花粉活力检测结果
植物花粉有无活力及花粉活力的高低会对雌蕊授粉成功率产生显著的影响。经检测，野豌豆属5个亚种植物的花粉活力在花瓣未展开和完全展开后表现出显著的差异，当花瓣未展开时，其花粉活力表现为77.3%～99.5%，而当花瓣完全展开后，花粉活力表现为63.4%～89.4%。其中，4、6、11、12、15、17、20、21、23和24号种质花粉活力在花瓣未展开时较高，均达99%以上;最低的为2号种质，仅为77.3%。而当花瓣完全展开后，所有种质的花粉活力均呈现出不同程度的下降趋势。其中，1、4、5、6、13、14、16、17、18、23和24号种质花粉活力仍能保持在85%以上，2号和11号种质完全展开后花粉活力均在80%以下，分别为63.4%和79.5%（见表2），11号种质花粉活力下降最快。表明野豌豆属植物花粉活力随着散粉时间的延长呈现降低的趋势，且降低幅度在不同亚种间及同一亚种的不同种质间存在显著差异。
2.2 柱头可授性检测结果
柱头可授性检测结果见表3。结果显示，5个野豌豆属亚种植物的柱头在花瓣未展开时便具有柱头可授性，且在花瓣展开后柱头可授性与未展开时相比基本无变化。其中，2、3、4、6、13、14、15、16、17、18、21、23和24号种质柱头可授性较强;8、10和22号种质在花瓣未展开时和完全展开后均显示仅具有可授性，表明这3份种质材料的柱头结合能力较其他种质弱;全部种质中只有2号种质的柱头可授性在花瓣完全展开后呈现出降低的趋势。表明野豌豆属植物柱头可授性的持续时间较长，且不同亚种间及同一亚种的不同种质间存在差异。
3 讨论
花粉活力是指植物产生的雄配子体在其花粉管中进行生长的能力[9]。植物花粉活力的强弱、保持活力的持续时间及授粉柱头的可授性均具有较大的差异，一是由于植物物种不同而产生的差异，二是不同的环境因素也会对这些性状产生较强的影响[7]。如血盆草（Salvia cavaleriei Levl. var. simplicifolia Stib.），其花粉在长达7 d时间内均可存在较强的活力。自然条件下，百日菊（Zinnia elegans Jacq.）在天气晴朗的上午采集的花粉活力要显著高于下午采集的花粉[10]。而本研究中，野豌豆属5个亚种植物的花粉活力在花瓣未展开时与完全展开后相比出现了较大幅度的降低，表明其花粉活力持续时间较短，开花后花粉活力会随着时间的延长而降低。因此，在后期杂交选育时应选取花瓣未展开的花朵进行，有利于提高授粉的成功率。同时，花粉活力检测结果表明24个种质花粉全部都具备了活力，但花粉染色的程度存在一定的区别，其中7、8、10、12、15号种质的花粉染色程度较浅，其花粉育性（受精的能力）的大小还需进一步的实验加以验证。 柱头可授期是植物的花朵在成熟过程中一个十分重要的时期，其在较大程度上影响了不同植物的自花传粉率及植物不同开花阶段的传粉成功率等[11]。不同植物柱头的可授期具有较大的差异，其能够持续的时间可从几个小时延续到十几天不等，影响柱头可授期的主要因素是花的年龄，一天内的不同授粉时间及授粉柱头分泌物的有无等，这些因素对其均有显著影响[7]。野生芍药（Paeonia lactiflora Pall.）的柱头分泌黏液的时期大约是其花朵开花后的2 h，而其柱头的可授性可以从开花第一天一直持续到第五天[11]。本研究中，野豌豆属5个亚种植物的柱头可授性在花瓣未展开时同完全展开后相比大多数无显著性改变，只有2号种质出现了明显的下降，可见野豌豆属植物柱头可授性持续时间较长。
结合花粉活力和柱头可授性实验结果，表明野豌豆属植物花粉活力较易受开花时间和温度等因素影响，而柱頭可授性受到影响较小。因此，后期进行人工杂交时应尽量在晴朗的上午，选择花瓣未展开的花蕾。
4 结论
野豌豆属植物在全球分布广泛，且属内植物大多数具有较高的经济价值，是重要的农业种质资源。花粉活力和柱头可授性是作物杂交育种成败与否的关键指标之一，对作物新品种选育十分重要。本研究结果表明，5个亚种的野豌豆属植物花粉活力和柱头可授性均较高，随着散粉时间的延长，其花粉活力逐渐降低。这对野豌豆属植物进行人工育种时杂交时间的选择具有重要参考价值。
参考文献：
[1] 南志标，张吉宇，王彦荣，等.五个箭筈豌豆品系基因型与环境互作效应及农艺性状稳定性[J].生态学报，2004，24（3）：395-401.
[2] 夏振岱.中国野豌豆属的分类研究[J].植物分类学报，1996，34（4）：421-433.
[3] Castiglione M R，Gelati M T，Frediani M，et al. Cytology of Vicia species X. karyotype evolution and phylogenetic implication in Vicia species of the sections Atossa，Microcarinae，Wiggersia and Vicia[J]. Protoplasm，2011，248（4）：707-716.
[4] Ball P W，Tutin T G，Heywood V H，et al. Flora Europaea[M]. Cambridge：Cambridge University Press，1968.
[5] Maxted N. A phenetic investigation of Vicia L. subgenus Vicia （Leguminosae，Vicieae）[J]. Botanical Journal of the Linnean Society，1993，111（2）：155-182.
[6] 王敏.影响大豆杂交成活率因素初探[J].安徽农学通报，2009，15（4）：61-62.
[7] 母贵琴，张 利，钟国成，等. 鼠尾草属3种植物花粉活力与柱头可授性[J].四川农业大学学报，2011，29（2）：203-206.
[8] 钟国成，张利，杨瑞武，等.丹参及其近缘种花粉活力与柱头可授性研究[J].中国中药杂志，2010，35（6）：686-689.
[9] Atlagic J. Pollen fertility in some Helianthus L. species and their F1 hybrids with the cultivated sunflower[J]. Helia，1990，13（13）：41-47.
[10] 叶要妹，张俊卫，齐迎春，等.百日草柱头可授性和花粉生活力的研究[J].中国农业科学，2007，40（10）：2376-2381.
[11] 红雨，刘强，韩岚.芍药花粉活力和柱头可授性的研究[J].广西植物，2003，23（1）：90-92.
（责任编辑：丁志祥）