【摘 要】
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为进一步建立蛋白诱导水牛iPS细胞体系,本实验对穿膜肽TAT与标记蛋白EGFP进行融合表达,同时引入核定位NLS序列,获得纯化蛋白后进行细胞共培养试验,以探讨穿膜肽TAT对携带水牛
【基金项目】
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中央高校基本科研业务费专项资金(XDJK2013C008);西南大学荣昌校区重点学科建设资助项目(K2012002)
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为进一步建立蛋白诱导水牛iPS细胞体系,本实验对穿膜肽TAT与标记蛋白EGFP进行融合表达,同时引入核定位NLS序列,获得纯化蛋白后进行细胞共培养试验,以探讨穿膜肽TAT对携带水牛干细胞转录因子纯化蛋白进入细胞内的效果。首先通过PCR扩增、TA克隆、双酶切以及T4连接等步骤构建原核表达载体pET-EGFP和pET-NLS-EGFP-TAT;再将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,用SDS-PAGE电泳检测融合蛋白表达;然后用HisTrap HP层析柱纯化融合蛋白,经复性、透析和浓缩后,最后将纯化的EGFP蛋白和NLSEGFP-TAT蛋白分别添加到水牛成纤维细胞中共培养。结果表明:成功表达了融合蛋白EGFP(47.3 ku)和NLSEGFP-TAT(50.1 ku);纯化蛋白与水牛成纤维细胞共培养5~8 h后,EGFP蛋白不能进入细胞内,而NLS-EGFPTAT蛋白在穿膜肽TAT的帮助下能够顺利进入细胞内,但未能显著定位到细胞核内。
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