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【摘要】目的：评价锗水增强免疫力作用；方法：随机选取120尾受精后2天（2 dpf）转基因中性粒细胞与巨噬细胞绿色荧光斑马鱼于六孔板中，每孔（实验组）均处理30尾斑马鱼，静脉窦注射给予红色荧光微球建立斑马鱼促吞噬模型。模型斑马鱼水溶给予4倍浓缩锗水和阳性对照药百令胶囊15 μg/mL浓度，同时设置正常对照组，每孔容量为3 mL。锗水处理结束后，每组随机取10尾斑马鱼在荧光显微镜下采集图片，用图像处理软件计算巨噬细胞荧光强度及巨噬细胞吞噬清除后荧光微球残留个数；结果：根据巨噬细胞荧光强度的统计学意义评价锗水对斑马鱼巨噬细胞生成的促进作用，根据荧光微球残留个数的统计学意义评价锗水对斑马鱼巨噬细胞吞噬的促进作用。
【关键词】锗水；斑马鱼；增强免疫力；吞噬细胞
[中图分类号]R979.5 [文献标识码]A [文章编号]2096-5249（2021）09-0222-03
Study on the enhancement of immunity by germanium water
TIAN Xiao-xue1， ZHANG Na2， LI Huai-ping1， ZHU Xiao-yu2， WU Hong-ge2*（1. ARURA Tibetan Medicine（Shan Dong）health industry co. Ltd ， Jinan Shandong 250100， China； 2. Zibo zichuan district hospital， Zibo Shandong255100， China； 3. Hunter Biotechnology， Inc. ， Hangzhou Zhejiang 310000， China）
[Abstract] Objective： to evaluate the immunity-enhancing effect of germanium water. Methods： 120 transgenic neutrophils and macrophage green fluorescent zebrafish randomly selected 2 days after fertilization in a six-well plate， and 30 zebrafish were cultured in each well（experimental group）. Red florescent microspheres were injected into the venous sinuses to establish the model of promoting phagocytosis in zebrafish. Model zebra look of soluble give four times concentrated water and positive control medicine best make Bailing capsules 15μg/mL. The concentration， at the same time set up the normal control group， each hole capacity of 3 ml. After treatment by the germanium water， each group andomly take 10 tail zebrafish acquisition mages under the fluorescence microscope， macrophage fluorescence intensity was calculated by the image processing software and residue after removal of macrophage cell fluorescent microspheres nueber； Results： according to the statistical significance if the fluorescence intensity of macrophages， the promoting effect of the wrong water on the generation of macrophages was evaluated， and the promoting effect of the wrong water on the phagocytosis of zebrafish macrophages was evaluated based on the statistical significance of the number of fluorescent microspheres.
[Key words] Germanium water； Zebra fish； Boost immunity； Phagocyte
鍺 （Ge）是俄国化学家门捷列夫1881年预言存在，德国化学家Winkler 1886 年从硫银锗矿中发现的，1913年Cor-ner从植物中测出了锗，1929年Duloit 从动物体内发现了锗[1-2]。
锗作为一种有益元素，其抗癌、保健的功效越来越受到人们的重视，有文献报道中探讨了富锗温泉治病、疗养功效的影响[3]，也有报道，在日本青森县童子山，人们发现那里的童子山涌泉中含较高锗，当地居民长期饮用该泉水，少有癌症发生[1]，天芳悦潭温泉水中已经证实其富有锗，锗水除具有抗癌的作用，是否具有其他作用呢？本次实验通过利用斑马鱼验证了由天芳悦潭提供的锗水经浓缩后具有增强免疫力的作用。
斑马鱼（Danio rerio）属于辐鳍亚纲（Actinoptery-gii）鲤科（Cyprinidae）短担尼鱼属（Danio），是生物医学和毒理学模型的最佳的模式生物之一[4-9]。斑马鱼是公认的生态毒理学模型。在上个世纪 70 年代，国外已经开始应用斑马鱼进行重金属和有机物的急性毒性研究[10]。 1 实验部分
1.1实验动物 转基因中性粒细胞与巨噬细胞绿色荧光斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行，共120尾，每实验组为30尾，年龄为受精后2天（2 dpf）（用于锗水促进巨噬细胞生成及吞噬作用评价）。以上斑马鱼均饲养于28℃的养鱼用水中（水质：每1 L反渗透水中加入200 mg速溶海盐，电导率为480～510 μS/cm；pH为6.9～7.2；硬度为53.7～71.6 mg/L CaCO3）。饲养管理符合国际AAALAC认证的要求。
1.2实验仪器 与装置SMZ645型解剖显微镜：Nikon公司产品；CP214型精密电子天平：奥豪斯公司产品；IM-300型显微注射仪：Narishige公司产品；PC-10型拉针仪：日本Narishige公司产品；SPX-250B-Z型生化培养箱：中国BOXUN公司产品；AZ100型电动聚焦连续变倍荧光显微镜：Nikon公司产品。
1.3实验材料 与试剂4倍浓缩锗水两批，无色透明液体，由天芳悦潭提供含锗温泉水，经金诃藏药（山东）健康产业有限公司进行浓缩后提供，一批供试品用于MTC测定，一批用于功效评价。百令胶囊，硬胶囊，内容为灰色至灰黄色粉末，批号为171105，厂家为杭州中美华东制药有限公司，使用前用超纯水配制成2 mg/mL的母液，现配现用。甲基纤维素：Sigma试剂公司；6孔板：Nest公司产品；荧光微球：L3030，Sigma试剂公司。
1.4实验方法
2 實验结果
2.1巨噬细胞生成促进作用 模型对照组巨噬细胞荧光强度为3783000像素，与正常对照组（3744020像素）比较P> 0.05，说明荧光微球造模对斑马鱼巨噬细胞生成无影响。百令胶囊15 μg/mL浓度组巨噬细胞荧光强度为4215617像素，与模型对照组（3783000像素）比较P<0.05，巨噬细胞生成促进率为11%，说明百令胶囊15 μg/mL浓度组对斑马鱼巨噬细胞生成有明显的促进作用。4倍浓缩锗水组巨噬细胞荧光强度为4375467，巨噬细胞生成促进率为16 %，与模型对照组（3783000像素）比较P< 0.01，说明4倍浓缩锗水组对斑马鱼巨噬细胞生成有明显的促进作用。详见表1、图1。
2.2巨噬细胞吞噬功能促进作用 百令胶囊15 μg/mL浓度组荧光微球残留个数为10个，与模型对照组（26个）比较P< 0.001，荧光微球清除作用为60%，说明百令胶囊15 μg/mL浓度组对斑马鱼巨噬细胞吞噬有明显的促进作用。4倍浓缩锗水组荧光微球残留个数为15个，与模型对照组（26个）比较P< 0.001，荧光微球清除作用为42%，说明4倍浓缩锗水组对斑马鱼巨噬细胞吞噬有明显的促进作用。详见表2、图2。
2.3实验结论 在本实验浓度条件下，4倍浓缩锗水对斑马鱼巨噬细胞生成有明显的促进作用，对斑马鱼巨噬细胞吞噬有明显的促进作用。
3 讨论
斑马鱼（Zebrafish， Danio rerio）是一种脊椎动物，与人类基因同源性高达87%，其信号传导通路与人类基本近似，生物结构和生理功能与哺乳动物高度相似 [11-12] ，由于体外培养、繁殖周期快、饲养成本低、体积小、发育周期短、体外受精、透明以观察、单次产卵数较高、给药量小及可进行高通量药物筛选试验，在心血管、神经及代谢等系统方面越来越受到研究者的欢迎[13]。因此本实验选用受精后2天（2 dpf）转基因中性粒细胞与巨噬细胞绿色荧光斑马鱼进行试验。根据实验结果可知，将天芳悦潭提供富含锗的温泉水浓缩4倍后对斑马鱼巨噬细胞生成和吞噬有明显的促进作用，具有一定的增强免疫力的作用，但其作用机理等方面的内容目前尚不清楚，后期需要继续进行深入的研究。
参考文献
[1] 刘禹若. 关于含锗饮用天然矿泉水几个问题的探讨[J]. 上海地质， 1994， 52（4）： 5-14.
[2] 李景岩. 有机锗与人体健康[J]. 现代预防医学， 2007， 34（13）： 2465-2467.
[3] 沈骁， 等. 青海贵德县扎仓温泉高锗泉水开发利用探讨[J]. 2016， 25（1）： 230-232.
[4] 常嘉， 陆亮， 常艳， 等. 斑马鱼胚胎发育毒性评价方法的建立[J].中国药理学与毒理学杂志， 2013， 27（3）： 590-591.
[5] 宋志慧， 王庆伟. Cu2+、Cd2+和Cr6+对斑马鱼联合毒性作用和生物预警的研究[J]. 生态毒理学报， 2011， 6（4）： 361-366.
[6] 宋明霞， 陈天荣， 钱豪文， 等. 3种重金属对斑马鱼的联合毒性及迷迭香酸的保护作用研究[J]. 烟台大学学报（自然科学与工程版）， 2020， 33（1）： 43-48.
[7] LAMMER E， CARR G J， WENDLER K， et al. Is thefish embryo toxicity test （FET） with the zebrafish （Danio rerio）a potential alternative for the fish acute toxicity test？ [J]. Com-parative Biochemistry&Physiology Part C Toxicology & Pharma-cology， 2009， 149（2）： 196-209.
[8] DAI Y J， JIA Y F， CHEN N， et al. Zebrafish as amodel system to study toxicology[J]. Environmental toxicology and chemistry， 2014， 33（1）： 11-17.
[9] ROCHA O P， DEOLIVEIRA D P. Investigation of a Brazilian tannery effluent by means of zebra fish （Danio rerio）embryo acute toxicity （FET） test[J]. J Toxicol Environ Health A， 2017， 80（19-21）： 1078-1085.
[10] 郭胜亚， 朱晓宇， 周佳丽， 等. 斑马鱼在功能性食品研究中的应用进展[J]. 中国实验动物学报， 2020， 28（1）： 143-147.
[11] Clark MD， Hennig S， Herwig R， et al. An oligonucleotide fingerprint normalized and expressed sequence tag characterized zebrafish cDNAlibrary [J]. Genome Res， 2001， 11（9）： 1594-1602.
[12] Postlethwait JH， Woods IG， Ngo-Hazelett P， et al. Zebrafish comparative genomics and the origins of vertebrate chromosomes [J]. GenomeRes， 2000， 10（12）： 1890-1902.
[13] 夏婧， 游秋云， 黄攀攀， 等. 中药酸枣仁对斑马鱼睡眠剥夺模型的行为学及神经递质受体的影响[J]. 时珍国医国药， 2019， 30 （9）： 2061-2064.
*通信作者：吴洪革，男，淄博市淄川区医院，药学专业。E_mail：wuhongge1978@126.com
【关键词】锗水；斑马鱼；增强免疫力；吞噬细胞
[中图分类号]R979.5 [文献标识码]A [文章编号]2096-5249（2021）09-0222-03
Study on the enhancement of immunity by germanium water
TIAN Xiao-xue1， ZHANG Na2， LI Huai-ping1， ZHU Xiao-yu2， WU Hong-ge2*（1. ARURA Tibetan Medicine（Shan Dong）health industry co. Ltd ， Jinan Shandong 250100， China； 2. Zibo zichuan district hospital， Zibo Shandong255100， China； 3. Hunter Biotechnology， Inc. ， Hangzhou Zhejiang 310000， China）
[Abstract] Objective： to evaluate the immunity-enhancing effect of germanium water. Methods： 120 transgenic neutrophils and macrophage green fluorescent zebrafish randomly selected 2 days after fertilization in a six-well plate， and 30 zebrafish were cultured in each well（experimental group）. Red florescent microspheres were injected into the venous sinuses to establish the model of promoting phagocytosis in zebrafish. Model zebra look of soluble give four times concentrated water and positive control medicine best make Bailing capsules 15μg/mL. The concentration， at the same time set up the normal control group， each hole capacity of 3 ml. After treatment by the germanium water， each group andomly take 10 tail zebrafish acquisition mages under the fluorescence microscope， macrophage fluorescence intensity was calculated by the image processing software and residue after removal of macrophage cell fluorescent microspheres nueber； Results： according to the statistical significance if the fluorescence intensity of macrophages， the promoting effect of the wrong water on the generation of macrophages was evaluated， and the promoting effect of the wrong water on the phagocytosis of zebrafish macrophages was evaluated based on the statistical significance of the number of fluorescent microspheres.
[Key words] Germanium water； Zebra fish； Boost immunity； Phagocyte
鍺 （Ge）是俄国化学家门捷列夫1881年预言存在，德国化学家Winkler 1886 年从硫银锗矿中发现的，1913年Cor-ner从植物中测出了锗，1929年Duloit 从动物体内发现了锗[1-2]。
锗作为一种有益元素，其抗癌、保健的功效越来越受到人们的重视，有文献报道中探讨了富锗温泉治病、疗养功效的影响[3]，也有报道，在日本青森县童子山，人们发现那里的童子山涌泉中含较高锗，当地居民长期饮用该泉水，少有癌症发生[1]，天芳悦潭温泉水中已经证实其富有锗，锗水除具有抗癌的作用，是否具有其他作用呢？本次实验通过利用斑马鱼验证了由天芳悦潭提供的锗水经浓缩后具有增强免疫力的作用。
斑马鱼（Danio rerio）属于辐鳍亚纲（Actinoptery-gii）鲤科（Cyprinidae）短担尼鱼属（Danio），是生物医学和毒理学模型的最佳的模式生物之一[4-9]。斑马鱼是公认的生态毒理学模型。在上个世纪 70 年代，国外已经开始应用斑马鱼进行重金属和有机物的急性毒性研究[10]。 1 实验部分
1.1实验动物 转基因中性粒细胞与巨噬细胞绿色荧光斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行，共120尾，每实验组为30尾，年龄为受精后2天（2 dpf）（用于锗水促进巨噬细胞生成及吞噬作用评价）。以上斑马鱼均饲养于28℃的养鱼用水中（水质：每1 L反渗透水中加入200 mg速溶海盐，电导率为480～510 μS/cm；pH为6.9～7.2；硬度为53.7～71.6 mg/L CaCO3）。饲养管理符合国际AAALAC认证的要求。
1.2实验仪器 与装置SMZ645型解剖显微镜：Nikon公司产品；CP214型精密电子天平：奥豪斯公司产品；IM-300型显微注射仪：Narishige公司产品；PC-10型拉针仪：日本Narishige公司产品；SPX-250B-Z型生化培养箱：中国BOXUN公司产品；AZ100型电动聚焦连续变倍荧光显微镜：Nikon公司产品。
1.3实验材料 与试剂4倍浓缩锗水两批，无色透明液体，由天芳悦潭提供含锗温泉水，经金诃藏药（山东）健康产业有限公司进行浓缩后提供，一批供试品用于MTC测定，一批用于功效评价。百令胶囊，硬胶囊，内容为灰色至灰黄色粉末，批号为171105，厂家为杭州中美华东制药有限公司，使用前用超纯水配制成2 mg/mL的母液，现配现用。甲基纤维素：Sigma试剂公司；6孔板：Nest公司产品；荧光微球：L3030，Sigma试剂公司。
1.4实验方法
2 實验结果
2.1巨噬细胞生成促进作用 模型对照组巨噬细胞荧光强度为3783000像素，与正常对照组（3744020像素）比较P> 0.05，说明荧光微球造模对斑马鱼巨噬细胞生成无影响。百令胶囊15 μg/mL浓度组巨噬细胞荧光强度为4215617像素，与模型对照组（3783000像素）比较P<0.05，巨噬细胞生成促进率为11%，说明百令胶囊15 μg/mL浓度组对斑马鱼巨噬细胞生成有明显的促进作用。4倍浓缩锗水组巨噬细胞荧光强度为4375467，巨噬细胞生成促进率为16 %，与模型对照组（3783000像素）比较P< 0.01，说明4倍浓缩锗水组对斑马鱼巨噬细胞生成有明显的促进作用。详见表1、图1。
2.2巨噬细胞吞噬功能促进作用 百令胶囊15 μg/mL浓度组荧光微球残留个数为10个，与模型对照组（26个）比较P< 0.001，荧光微球清除作用为60%，说明百令胶囊15 μg/mL浓度组对斑马鱼巨噬细胞吞噬有明显的促进作用。4倍浓缩锗水组荧光微球残留个数为15个，与模型对照组（26个）比较P< 0.001，荧光微球清除作用为42%，说明4倍浓缩锗水组对斑马鱼巨噬细胞吞噬有明显的促进作用。详见表2、图2。
2.3实验结论 在本实验浓度条件下，4倍浓缩锗水对斑马鱼巨噬细胞生成有明显的促进作用，对斑马鱼巨噬细胞吞噬有明显的促进作用。
3 讨论
斑马鱼（Zebrafish， Danio rerio）是一种脊椎动物，与人类基因同源性高达87%，其信号传导通路与人类基本近似，生物结构和生理功能与哺乳动物高度相似 [11-12] ，由于体外培养、繁殖周期快、饲养成本低、体积小、发育周期短、体外受精、透明以观察、单次产卵数较高、给药量小及可进行高通量药物筛选试验，在心血管、神经及代谢等系统方面越来越受到研究者的欢迎[13]。因此本实验选用受精后2天（2 dpf）转基因中性粒细胞与巨噬细胞绿色荧光斑马鱼进行试验。根据实验结果可知，将天芳悦潭提供富含锗的温泉水浓缩4倍后对斑马鱼巨噬细胞生成和吞噬有明显的促进作用，具有一定的增强免疫力的作用，但其作用机理等方面的内容目前尚不清楚，后期需要继续进行深入的研究。
参考文献
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[5] 宋志慧， 王庆伟. Cu2+、Cd2+和Cr6+对斑马鱼联合毒性作用和生物预警的研究[J]. 生态毒理学报， 2011， 6（4）： 361-366.
[6] 宋明霞， 陈天荣， 钱豪文， 等. 3种重金属对斑马鱼的联合毒性及迷迭香酸的保护作用研究[J]. 烟台大学学报（自然科学与工程版）， 2020， 33（1）： 43-48.
[7] LAMMER E， CARR G J， WENDLER K， et al. Is thefish embryo toxicity test （FET） with the zebrafish （Danio rerio）a potential alternative for the fish acute toxicity test？ [J]. Com-parative Biochemistry&Physiology Part C Toxicology & Pharma-cology， 2009， 149（2）： 196-209.
[8] DAI Y J， JIA Y F， CHEN N， et al. Zebrafish as amodel system to study toxicology[J]. Environmental toxicology and chemistry， 2014， 33（1）： 11-17.
[9] ROCHA O P， DEOLIVEIRA D P. Investigation of a Brazilian tannery effluent by means of zebra fish （Danio rerio）embryo acute toxicity （FET） test[J]. J Toxicol Environ Health A， 2017， 80（19-21）： 1078-1085.
[10] 郭胜亚， 朱晓宇， 周佳丽， 等. 斑马鱼在功能性食品研究中的应用进展[J]. 中国实验动物学报， 2020， 28（1）： 143-147.
[11] Clark MD， Hennig S， Herwig R， et al. An oligonucleotide fingerprint normalized and expressed sequence tag characterized zebrafish cDNAlibrary [J]. Genome Res， 2001， 11（9）： 1594-1602.
[12] Postlethwait JH， Woods IG， Ngo-Hazelett P， et al. Zebrafish comparative genomics and the origins of vertebrate chromosomes [J]. GenomeRes， 2000， 10（12）： 1890-1902.
[13] 夏婧， 游秋云， 黄攀攀， 等. 中药酸枣仁对斑马鱼睡眠剥夺模型的行为学及神经递质受体的影响[J]. 时珍国医国药， 2019， 30 （9）： 2061-2064.
*通信作者：吴洪革，男，淄博市淄川区医院，药学专业。E_mail：wuhongge1978@126.com