研究缺氧对肠上皮细胞丝切蛋白活化的影响及丝切蛋白活化与紧密连接蛋白带状闭合蛋白1(ZO–1)分布变化的关系。

建立人肠上皮细胞株Caco–2单层细胞培养模型，取部分细胞按照随机数字表法分为对照组(不处理)、缺氧组(置于缺氧环境下)和常氧组(置于常氧环境下)，取对照组细胞(样本数为9)及其他2组培养1、2、6、12、24 h的细胞(各时相点样本数均为9)采用蛋白质印迹法检测丝切蛋白及磷酸化丝切蛋白的表达。另取细胞，按照随机数字表法分为缺氧组和对照组(处理同前)，取对照组细胞和缺氧组缺氧1、2、6、12、24 h的细胞采用激光扫描共聚焦显微镜观察纤维状肌动蛋白的形态与分布，荧光法检测纤维状肌动蛋白与球状肌动蛋白含量的比值，激光扫描共聚焦显微镜观察细胞形态及ZO–1的分布；该3个实验中对照组样本数依次为3、6、3，缺氧组各时相点样本数依次为3、6、3。对数据行重复测量方差分析、配对t检验、LSD–t检验。

与对照组比较，常氧组细胞培养1～24 h丝切蛋白及磷酸化丝切蛋白表达量均无明显变化(t值分别为–0.385～1.701、0.040～1.538，P值均大于0.05)。与对照组比较，缺氧组细胞培养1～24 h丝切蛋白表达量也无明显变化(t值为1.032～2.390，P值均大于0.05)；但磷酸化丝切蛋白表达量均明显降低(t值为4.563～22.678，P值均小于0.01)，其中培养24 h降至最低值。常氧组、缺氧组细胞各时相点丝切蛋白表达量相近(t值为–0.904～1.433，P值均大于0.05)；缺氧组细胞培养1、2、6、12、24 h时磷酸化丝切蛋白表达量分别为0.87±0.08、0.78±0.05、0.89±0.07、0.68±0.07、0.57±0.06，均低于常氧组(0.90±0.07、0.97±0.06、1.00±0.06、1.00±0.05、0.99±0.05, t值为3.193～16.434，P值均小于0.01)。对照组细胞胞质内纤维状肌动蛋白丰富，大多呈束状；缺氧组细胞从缺氧1 h起纤维状肌动蛋白走向混乱、长度变短甚至消散。缺氧组细胞缺氧12、24 h时纤维状肌动蛋白与球状肌动蛋白含量比值分别为0.89±0.12、0.84±0.19，均明显低于对照组(1.00，t值分别为3.622、3.577, P值均小于0.01)；其余时相点两者的比值与对照组接近(t值为0.447～1.526, P值均大于0.05)。对照组细胞排列紧密，ZO–1沿细胞膜连续分布；缺氧组从缺氧2 h起细胞形态不规则，其中缺氧24 h时ZO–1沿细胞膜分布不再连续，出现断裂。

缺氧可能通过诱导肠上皮细胞丝切蛋白活化，引起纤维状肌动蛋白与球状肌动蛋白动态平衡失调，从而导致紧密连接蛋白ZO–1分布发生改变。