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【关键词】过氧化物酶体增殖物激活受体-γ;胰腺癌;细胞增殖
胰腺癌是消化系统恶性程度高、预后差的恶性肿瘤之一，由于其侵袭性强，早期往往已经浸润大血管、神经等，造成手术切除难度大，严重降低生存率，5年总体生存率不足1%[1]。过氧化物酶体增殖物-γ（PPAR-γ）除参与脂肪代谢、炎症反应和细胞周期的调控等细胞功能调节外，还与肿瘤发生关系密切[2]。笔者前期试验表明促进PPAR-γ表达可以有效抑制人胰腺癌BxPc-3细胞上皮间充质转化（EMT）及侵袭性[3]。本实验拟明确调控PPAR-γ表达对BxPc-3细胞增殖活性的影响。
材料与方法
一、材料
人胰腺癌BxPc-3细胞购自上海中科院细胞研究所;PPAR-γ激动剂罗格列酮购自美国Sigma;胰酶、高糖DMEM培养基购自美国Gibco公司;四甲基偶氮唑蓝（MTT）试剂盒购自中国碧云天公司;鼠抗人PPAR-γ抗体及GAPDH内参购自南京凯基公司。
二、方法
1.细胞株与培养
人胰腺癌BxPc-3细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液于37℃、5%CO2培养箱中培养，细胞均呈贴壁生长。每2～3d用0.25%胰酶消化传代1次。根据前期研究经验，将BxPc-3细胞分5组处理96h，分别为不加药物的对照组（对照组）、加入终浓度5μmol/L罗格列酮组（5μmol/L罗格列酮组）、加入终浓度10μmol/L罗格列酮组（10μmol/L罗格列酮组）、加入终浓度20μmol/L罗格列酮组（20μmol/L罗格列酮组）、加入终浓度40μmol/L罗格列酮组（40μmol/L罗格列酮组）。
2.PPAR-γ表达水平的检测
采用蛋白免疫印迹法：收集对数生长期BxPc-3细胞，各组BxPc-3细胞加药后加入600μlRIPA细胞裂解液，离心30min，收集上清液即总蛋白，加2倍体积十二烷基酸钠上样缓冲液，电泳后转移至醋酸纤维膜上，脱脂奶粉封闭，加入相应一抗（PPAR-γ抗体，1∶100），4℃孵育过夜，洗膜3次，加入羊抗鼠二抗（1∶10000），37℃孵育2h，电化学发光（ECL）法检测，感光顯影。AlphaImager2200图像系统分析灰度值，以GAPDH为内参，计算各组细胞的PPAR-γ表达水平。实验组每组设4个平行孔，实验独立重复3次，结果取平均值。
3.BxPc-3细胞增殖活性的检测
3.BxPc-3细胞增殖活性的检测采用MTT法检测：收集对数生长期的BxPc-3细胞，各组BxPc-3细胞加药处理后加入20μlMTT溶液，孵育4h，再加入150μl二甲基亚砜（DMSO）震荡10min，使用ELISA检测仪于490nm波长处测量各组吸光度值（增殖活性）。每组设4个平行孔，实验独立重复3次，结果取平均值。
三、统计学处理
使用SPSS16.0处理数据。实验数据用表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较行LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
结果
一、不同浓度罗格列酮对BxPc-3细胞PPAR-γ表达水平的影响
5组BxPc-3细胞PPAR-γ表达水平比较差异有统计学意义（F=40.922，P<0.001）。5μmol/L罗格列酮组、10μmol/L罗格列酮组BxPc-3细胞的PPAR-γ表达水平与对照组比较差异均无统计学意义（P均>0.05），但20μmol/L罗格列酮组、40μmol/L罗格列酮组BxPc-3细胞的PPAR-γ表达水平升高，与对照组比较差异均有统计学意义（P均<0.05），且40μmol/L罗格列酮组BxPc-3细胞的PPAR-γ表达水平高于5μmol/L罗格列酮组、10μmol/L罗格列酮组和20μmol/L罗格列酮组（P均<0.05），见图1。
二、不同浓度罗格列酮对BxPc-3细胞增殖活性的影响
MTT检测显示，5组BxPc-3细胞增殖活性比较差异有统计学意义（F=19.966，P<0.001）。5μmol/L罗格列酮组、10μmol/L罗格列酮处理后BxPc-3细胞增殖活性分别为0.60±0.07、0.57±0.06，与对照组的0.62±0.09比较差异均无统计学意义（P均>0.05）;40μmol/L罗格列酮组细胞增殖活性为0.30±0.02，低于20μmol/L罗格列酮组的0.45±0.03，且2组BxPc-3细胞增殖活性均低于对照组、5μmol/L罗格列酮组和10μmol/L罗格列酮组（P均<0.05），见图2。
讨论
PPAR是一类由配体激活的转录因子，有α、β和γ这3种亚型，3种亚型在功能和结构有一定差异[4]。PPAR-γ配体分为外源性和内源性2大类，其中外源性配体以胰岛素增敏剂噻唑烷二酮类药物为代表，包括罗格列酮、吡格列酮等，临床用于治疗胰岛素抵抗、糖尿病等，内源性配体则包括一些不饱和脂肪酸及其代谢产物，如花生四烯酸、亚油酸等，还有前列腺素衍生物、前列腺素D2等，这些天然激动剂活性都较低[5-6]。
PPAR-γ最初发现是与胰岛素抵抗、脂肪细胞分化和器官纤维化等有关。近年研究显示其与肿瘤发生关系密切。已有报道PPAR-γ在胃癌、结肠癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、乳腺癌、食管癌和淋巴瘤等多种恶性肿瘤中表达[7]。Tsujie等（2003年）报道PPAR-γ在包括BxPc-3细胞在内的6种胰腺癌细胞株上表达。Kristiansen等（2006年）在129例胰腺癌患者的癌组织中检测PPAR-γ，71.3%的病例中有PPAR-γ的表达，且其表达与胰腺癌的分级和分期呈正相关，推测PPAR-γ与胰腺癌有关。PPAR-γ在胰腺癌中的确切作用机制尚未阐明。Eibl等（2001年）认为，PPAR-γ可能通过诱导胰腺癌细胞凋亡，进而阻止胰腺癌细胞生长。
笔者前期研究使用罗格列酮促进BxPc-3细胞中PPAR-γ表达，结果显示罗格列酮可以有效抑制人胰腺癌BxPc-3细胞EMT及侵袭性。本实验中笔者继续将不同浓度罗格列酮作用于BxPc-3细胞，结果显示20、40μmol/L罗格列酮可以有效促进PPAR-γ的表达，且40μmol/L罗格列酮组BxPc-3细胞的PPAR-γ表达高于20μmol/L罗格列酮组。MTT结果提示20μmol/L罗格列酮组、40μmol/L罗格列酮组BxPc-3细胞增殖活性明显下降，表明PPAR-γ表达可以有效抑制人胰腺癌BxPc-3细胞增殖活性。
综上所述，本研究结果初步揭示了PPAR-γ激动剂的抗胰腺癌细胞增殖特性，而探索PPAR-γ参与人胰腺癌BxPc-3细胞增殖及EMT的信号传导通路将是我们下一步的研究方向。
胰腺癌是消化系统恶性程度高、预后差的恶性肿瘤之一，由于其侵袭性强，早期往往已经浸润大血管、神经等，造成手术切除难度大，严重降低生存率，5年总体生存率不足1%[1]。过氧化物酶体增殖物-γ（PPAR-γ）除参与脂肪代谢、炎症反应和细胞周期的调控等细胞功能调节外，还与肿瘤发生关系密切[2]。笔者前期试验表明促进PPAR-γ表达可以有效抑制人胰腺癌BxPc-3细胞上皮间充质转化（EMT）及侵袭性[3]。本实验拟明确调控PPAR-γ表达对BxPc-3细胞增殖活性的影响。
材料与方法
一、材料
人胰腺癌BxPc-3细胞购自上海中科院细胞研究所;PPAR-γ激动剂罗格列酮购自美国Sigma;胰酶、高糖DMEM培养基购自美国Gibco公司;四甲基偶氮唑蓝（MTT）试剂盒购自中国碧云天公司;鼠抗人PPAR-γ抗体及GAPDH内参购自南京凯基公司。
二、方法
1.细胞株与培养
人胰腺癌BxPc-3细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液于37℃、5%CO2培养箱中培养，细胞均呈贴壁生长。每2～3d用0.25%胰酶消化传代1次。根据前期研究经验，将BxPc-3细胞分5组处理96h，分别为不加药物的对照组（对照组）、加入终浓度5μmol/L罗格列酮组（5μmol/L罗格列酮组）、加入终浓度10μmol/L罗格列酮组（10μmol/L罗格列酮组）、加入终浓度20μmol/L罗格列酮组（20μmol/L罗格列酮组）、加入终浓度40μmol/L罗格列酮组（40μmol/L罗格列酮组）。
2.PPAR-γ表达水平的检测
采用蛋白免疫印迹法：收集对数生长期BxPc-3细胞，各组BxPc-3细胞加药后加入600μlRIPA细胞裂解液，离心30min，收集上清液即总蛋白，加2倍体积十二烷基酸钠上样缓冲液，电泳后转移至醋酸纤维膜上，脱脂奶粉封闭，加入相应一抗（PPAR-γ抗体，1∶100），4℃孵育过夜，洗膜3次，加入羊抗鼠二抗（1∶10000），37℃孵育2h，电化学发光（ECL）法检测，感光顯影。AlphaImager2200图像系统分析灰度值，以GAPDH为内参，计算各组细胞的PPAR-γ表达水平。实验组每组设4个平行孔，实验独立重复3次，结果取平均值。
3.BxPc-3细胞增殖活性的检测
3.BxPc-3细胞增殖活性的检测采用MTT法检测：收集对数生长期的BxPc-3细胞，各组BxPc-3细胞加药处理后加入20μlMTT溶液，孵育4h，再加入150μl二甲基亚砜（DMSO）震荡10min，使用ELISA检测仪于490nm波长处测量各组吸光度值（增殖活性）。每组设4个平行孔，实验独立重复3次，结果取平均值。
三、统计学处理
使用SPSS16.0处理数据。实验数据用表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较行LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
结果
一、不同浓度罗格列酮对BxPc-3细胞PPAR-γ表达水平的影响
5组BxPc-3细胞PPAR-γ表达水平比较差异有统计学意义（F=40.922，P<0.001）。5μmol/L罗格列酮组、10μmol/L罗格列酮组BxPc-3细胞的PPAR-γ表达水平与对照组比较差异均无统计学意义（P均>0.05），但20μmol/L罗格列酮组、40μmol/L罗格列酮组BxPc-3细胞的PPAR-γ表达水平升高，与对照组比较差异均有统计学意义（P均<0.05），且40μmol/L罗格列酮组BxPc-3细胞的PPAR-γ表达水平高于5μmol/L罗格列酮组、10μmol/L罗格列酮组和20μmol/L罗格列酮组（P均<0.05），见图1。
二、不同浓度罗格列酮对BxPc-3细胞增殖活性的影响
MTT检测显示，5组BxPc-3细胞增殖活性比较差异有统计学意义（F=19.966，P<0.001）。5μmol/L罗格列酮组、10μmol/L罗格列酮处理后BxPc-3细胞增殖活性分别为0.60±0.07、0.57±0.06，与对照组的0.62±0.09比较差异均无统计学意义（P均>0.05）;40μmol/L罗格列酮组细胞增殖活性为0.30±0.02，低于20μmol/L罗格列酮组的0.45±0.03，且2组BxPc-3细胞增殖活性均低于对照组、5μmol/L罗格列酮组和10μmol/L罗格列酮组（P均<0.05），见图2。
讨论
PPAR是一类由配体激活的转录因子，有α、β和γ这3种亚型，3种亚型在功能和结构有一定差异[4]。PPAR-γ配体分为外源性和内源性2大类，其中外源性配体以胰岛素增敏剂噻唑烷二酮类药物为代表，包括罗格列酮、吡格列酮等，临床用于治疗胰岛素抵抗、糖尿病等，内源性配体则包括一些不饱和脂肪酸及其代谢产物，如花生四烯酸、亚油酸等，还有前列腺素衍生物、前列腺素D2等，这些天然激动剂活性都较低[5-6]。
PPAR-γ最初发现是与胰岛素抵抗、脂肪细胞分化和器官纤维化等有关。近年研究显示其与肿瘤发生关系密切。已有报道PPAR-γ在胃癌、结肠癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、乳腺癌、食管癌和淋巴瘤等多种恶性肿瘤中表达[7]。Tsujie等（2003年）报道PPAR-γ在包括BxPc-3细胞在内的6种胰腺癌细胞株上表达。Kristiansen等（2006年）在129例胰腺癌患者的癌组织中检测PPAR-γ，71.3%的病例中有PPAR-γ的表达，且其表达与胰腺癌的分级和分期呈正相关，推测PPAR-γ与胰腺癌有关。PPAR-γ在胰腺癌中的确切作用机制尚未阐明。Eibl等（2001年）认为，PPAR-γ可能通过诱导胰腺癌细胞凋亡，进而阻止胰腺癌细胞生长。
笔者前期研究使用罗格列酮促进BxPc-3细胞中PPAR-γ表达，结果显示罗格列酮可以有效抑制人胰腺癌BxPc-3细胞EMT及侵袭性。本实验中笔者继续将不同浓度罗格列酮作用于BxPc-3细胞，结果显示20、40μmol/L罗格列酮可以有效促进PPAR-γ的表达，且40μmol/L罗格列酮组BxPc-3细胞的PPAR-γ表达高于20μmol/L罗格列酮组。MTT结果提示20μmol/L罗格列酮组、40μmol/L罗格列酮组BxPc-3细胞增殖活性明显下降，表明PPAR-γ表达可以有效抑制人胰腺癌BxPc-3细胞增殖活性。
综上所述，本研究结果初步揭示了PPAR-γ激动剂的抗胰腺癌细胞增殖特性，而探索PPAR-γ参与人胰腺癌BxPc-3细胞增殖及EMT的信号传导通路将是我们下一步的研究方向。