【摘 要】
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目的 构建人AKT3基因的重组腺病毒表达载体,探究其对人乳腺导管癌细胞增殖的影响.方法应用RT-PCR方法从流产胎儿脑组织总RNA中扩增出AKT3 cDNA,以XhoⅠ及BglⅡ酶切位点克隆入
【机 构】
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南京军区福州总医院分子医学研究中心
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目的 构建人AKT3基因的重组腺病毒表达载体,探究其对人乳腺导管癌细胞增殖的影响.方法应用RT-PCR方法从流产胎儿脑组织总RNA中扩增出AKT3 cDNA,以XhoⅠ及BglⅡ酶切位点克隆入腺病毒pShuttle-IRES-hrGFP-1穿梭载体,测序鉴定后与骨架载体PAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组,获得重组腺病毒表达载体pAd-AKT3后,转染293A细胞,进行病毒的包装.荧光显微镜下观察细胞内绿色荧光,测定病毒效价,Western印迹方法分析细胞内AKT3蛋白质的表达.通过MTT实验,研究AKT3过表达前后BT474乳腺导管癌细胞增殖的变化.结果 重组载体经酶切鉴定和测序证实目的 基因正确无误.重组腺病毒效价为2.6×108 pfu /ml,重组腺病毒转导后,BT474乳腺导管癌细胞中可检测到AKT3的过表达:Western印迹检测结果显示AKT3融合蛋白在BT474细胞中表达良好,而转导空载体腺病毒及未转导细胞对照中未见有此融合蛋白质条带;MTT结果显示AKT3表达上调的重组腺病毒组,其增殖活性显著高于转导空载体腺病毒组及未转导细胞组,差异具有统计学意义(P﹤0.01),而后两者差异无统计学意义(P﹥0.05).结论 成功地构建了AKT3重组腺病毒表达载体,AKT3过表达可增强BT474乳腺导管癌的增殖,为进一步研究AKT3的功能奠定了基础.
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