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[摘 要] 目的：观察银杏达莫注射液对血管性痴呆大鼠的学习记忆及海马区神经元干预作用。 方法：大鼠分为三组：假手术组、安慰剂组、银杏达莫组。采用改良双侧颈总动脉阻断方法制备血管性痴呆大鼠模型。利用Morris水迷宫评价大鼠的学习记忆能力，显微镜观察海马区CA1区神经元的组织形态结构。结果：与假手术相比，安慰剂组大鼠平均逃避潜伏期明显延长（P<0.05），而银杏达莫组大鼠平均潜伏期较安慰剂组明显减少（P<0.05）。形态学观察显示安慰剂组大鼠海马CA1区神经细胞排列紊乱、数量较少，甚至神经细胞坏死、凋亡。银杏达莫组大鼠海马CA1区神经元数目、形态较安慰剂组均有明显改善。结论：银杏达莫注射液对VD大鼠海马CA1区神经细胞具有保护作用，从而改善血管性痴呆大鼠的学习记忆能力。
[关键词] 血管性痴呆；大鼠；银杏达莫；海马区；学习记忆
中图分类号：R285.5 文献标识码：B 文章编号：2095-5200（2015）06-030-03
DOI：10.11876/mimt201506012
血管性痴呆（Vascular dementia，VD）是指各种脑血管疾病引起脑功能障碍而产生的获得性智能损害综合症，以高级神经认知功能障碍，如学习记忆、认知功能受损等为主要表现，可伴有一系列异常神经心理症状和精神行为，是继阿尔茨海默病之后第二大痴呆疾。VD可以防治，早期治疗，具有可逆性[1-2]。目前，已有文献报道：银杏达莫注射液具有改善脑部微循环、营养神经、清除自由基、抑制神经细胞凋亡，改善由于脑缺血引起症状和记忆功能等功效[3]。银杏达莫注射液对血管性痴呆具有较好临床疗效，但机制研究证据较少。本研究在动物模型上观察银杏达莫注射液对血管性痴呆治疗效果及可能的治疗机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料
实验对象为健康雄性SD大鼠，数量30只，体重在250～300g，SPF级。OPJ-1B型切片机由天津天利航空机电有限公司生产；80i正置显微镜由日本Nikon生产；Morris水迷宫由中国医学科学院药物研究所研制生产。银杏达莫注射液（国药准字H52020032），由贵州益佰制药股份有限公司生产。
1.2 实验方法与分组
SD大鼠经1周适应性饲养，采用Morris水迷宫筛选实验动物，淘汰不能胜任水迷宫大鼠。将符合要求大鼠随机选出20只，改良双侧颈总动脉阻断方法制备血管性痴呆动物模型，余下10只为假手术组，给予相应手术处理但不阻断双侧颈总动脉。手术死亡大鼠剔除实验，并补充相应数目大鼠。术后第2天将造模大鼠，随机分为2组：银杏达莫组给予银杏达莫注射液（剂量为2.7mg/kg）静脉注射 [4]，安慰剂组、假手术组给予等体积生理盐水静脉注射，疗程为2周[5]。治疗结束后，利用Morris水迷宫装置对各组大鼠进行定位航行试验，记录各组大鼠逃避潜伏期。
1.3 制备血管性痴呆动物模型
改良双侧颈总动脉（CAA）阻断法制备血管性痴呆模型[6]。术前12h禁食，10%水合氯醛（350mg/kg体重）腹腔麻醉，取仰卧位，固定于手术台上；行相关手术前准备，颈部正中切口，依次切开皮肤、皮下组织，分离肌肉、血管、神经，充分暴露一侧颈总动脉，给予结扎、剪断该血管；依次缝合肌肉、皮下组织及皮肤。间隔7天后，同样方法再次处理对侧颈总动脉。
1.4 大鼠学习记忆能力测定
利用Morris水迷宫对各组大鼠进行学习记忆评估[7]。定位航行实验（水下任务实验），记录大鼠从入水至爬上平台时间，即逃避潜伏期。逃避潜伏期长短可以客观反映大鼠空间学习记忆能力。连续进行5天定向航行试验，每日4次（上午、下午各2次）。大鼠第5天4次平均逃避潜伏期为该大鼠最终测试时间。
1.5 大鼠脑组织HE切片
大鼠经10%水合氯醛（350mg/Kg）腹腔麻醉，经心脏灌注生理盐水50mL，再用含2%多聚甲醛、1%戊二醛混合液100～250mL灌注固定，时间不超过6min，1h后取脑，每个标本放入4%多聚甲醛PBS溶液中固定4～6h，沿矢状位切成小块，在30%蔗糖溶液中脱水12h后包埋于石蜡中。采用苏木素-伊红（HE染色）脑组织切片，光学显微镜下（×400）观察海马CA1区神经细胞形态及数目。
1.6 统计学处理
应用SPSS18.0统计软件进行相关数据统计学分析，数据用x±s表示。
2 结果
2.1 三组大鼠症状表现
双侧颈总动脉假阻断术后当日大鼠表现为运动减少、进食及饮水较少，之后逐渐恢复。术后2周时假手术组大鼠表现为进食水、活动及精神状态、毛发光泽度恢复至术前水平。安慰剂组表现为大鼠进食、饮水逐渐恢复，目光迟钝，活动量较术前明显减少，毛发脏乱，缺少光泽，对外界刺激反应淡漠。银杏迖莫组大鼠表现为活动量较手术前稍减少、毛发粗糙、欠光泽，对外界反应迟钝。
2.2 大鼠定位航行试验
假手术组平均逃避潜伏期为（12.91±4.86）s；安慰剂组平均逃避潜伏期为（36.92±7.64）s。与假手术组相比，血管痴呆组平均逃避潜伏期明显延长（P<0.05），说明该组SD大鼠出现了学习记忆功能受损。而银杏达莫组大鼠平均逃避潜伏期为（28.23±7.21）s。与安慰剂组相比，银杏达莫组平均逃避潜伏期明显缩短（P<0.05），但与假手术组相比，银杏达莫组平均逃避潜伏期仍延长（P<0.05）。
2.3 银杏达莫对血管性痴呆大鼠海马CA1区神经元
影响
假手术组SD大鼠脑海马CA1区HE染色显示：海马区CA1区神经元细胞呈圆形或椭圆型，细胞核染成淡蓝色，与细胞桨界限清晰，细胞排列紧密，外形规则，呈3～5层排列，未见异常结构（见图A）。安慰剂组大鼠海马CA1区HE染色可见：海马锥体细胞排列紊乱、细胞间隙增大，细胞数目明显减少，细胞核与胞浆分界不清，出现核固缩、变形，可见软化灶、细胞坏死明显（见图B）。银杏达莫组海马区组织切片可见：细胞体积变大，细胞水肿，细胞局部坏死；细胞排列较整齐，可见多层排列轮廓，海马CA1神经元数目、形态较安慰剂组均有明显改善（见图C）。 3 讨论
银杏达莫注射液是以银杏叶提取物为基础复合制剂，主要有效成分为银杏内酯类、银杏黄酮苷、百果内酯、双嘧达莫等；具有改善微循环、抗血小板聚集、清除氧自由基、抑制脂质过氧化等多重药理作用，可以防止细胞内钙离子超载、拮抗谷氨酸等兴奋性氨基酸引起神经毒性[8-9]。大量临床研究发现，银杏达莫注射液对血管性痴呆治疗预防疗效确切，但其治疗血管性痴呆机制尚未阐明[5，10]。本研究通过观察银杏达莫注射液对VD大鼠学习记忆功能及海马CA1区神经细胞影响，探讨VD发病机制和银杏达莫治疗VD作用机制。
本实验采用Morris水迷宫评价大鼠学习和记忆能力，其所测量指标为大鼠逃避潜伏期；逃避潜伏时间越长，学习记忆能力越差。本研究显示：银杏达莫组大鼠平均逃避潜伏期较安慰剂组明显缩短（P<0.05）；但与假手术组相比，银杏迖莫组平均逃避潜伏期仍延长（P<0.05）。因此，该研究表明银杏达莫注射液可以有效改善血管性痴呆大鼠学习记忆能力，但不能使其达到正常大鼠学习记忆水平。
海马作为大脑边缘系统主要组成部分，参与学习、记忆、情绪调节等功能活动，被认为学习记忆关键脑区[11]。临床上，学习记忆受损常是血管性痴呆患者首发和较为突出症状。研究表明，血管性痴呆患者学习记忆受损与海马区神经元变性、坏死、凋亡关系密切[12-15]。本研究也显示：银杏达莫组大鼠海马CA1区神经元细胞较少表现为变性、坏死及凋亡特征，其神经元细胞数目明显多于安慰剂组。海马与动物学习记忆关系最为密切。由此可以推测，银杏达莫改善血管性痴呆大鼠学习记忆能力，其可能通过增强海马区神经元对缺氧耐受、抑制海马区神经元坏死及凋亡、修复损伤神经等多靶点调控机制，从而保护海马区神经元数量及功能。
综上所述，本研究显示：银杏达莫注射液通过对海马CA1区神经细胞保护作用，显著改善VD大鼠学习记忆能力，其可能机制为减轻脑缺血再灌注损伤，抑制海马神经元坏死、凋亡，修复神经损伤。但具体作用机制还有待于进一步研究。
参 考 文 献
[1] Fujihara I，Sadanori S，Abekura H，et al. Relationship between behavioral and psychological symptoms of dementia and oral health status in the elderly with vascular dementia[J]. Gerodontology，2012，30（2）：157-61.
[2] 高康，张庆萍，李飞，等.血管性痴呆早期诊断方法应用进展[J].山东医药，2012，52（26）：90-92.
[3] 高秀菊. 银杏达莫联合吡拉西坦治疗血管性痴呆疗效[J].中国老年学杂志，2012，32（3）：593-594.
[4] 何晓静，黄琳仪，刘玉兰.注射用银杏达莫安全性评价[J].中国实验方剂学杂志，2006，（12）8：52-55.
[5] 程华英.银杏达莫注射液治疗血管性痴呆疗效观察[J].中国民康医学，2010，22（15）：1963-4.
[6] 黄文革，郭芬芬，刘慰华，等.血管性痴呆动物模型制作方法改良[J].中国比较医学杂志，2011，21（5）：49-52.
[7] Schenk F，Morris RG. Dissociation between components of spatial memory in rats after recovery from the effects of retrohippocampal lesions[J]. Exp Brain Res，1985，58（1）：11-28.
[8] 许成勇，黄泉智，王发渭.中药复方对拟血管性性痴呆模型损伤级联反应影响研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（7）：259-261.
[9] 黄鹤.银杏达莫注射液联合常规西药治疗血管性痴呆疗效评价[J].中医药临床杂志，2013，25（5）：440-443.
[10] Rocher MN，Carré D，Spinnewyn B，et al. Long-term treatment with standardized Ginkgo biloba extract （EGb 761） attenuates cognitive deficits and hippocampal neuron loss in a gerbil model of vascular dementia[J]. Fitoterapia，2011，82（7）：1075-1080.
[11] 张岚，程敬亮. 血管性痴呆大鼠脑血流、行为学和形态学对比及磁共振灌注成像应用价值[J].中国医学影像学杂志，2013，21（7）：485-489.
[12] Wais PE， Wixted JT，Hopkins RO，et al. The Hippocampus supports both the recollection and the familiarity components of recognition memory[J]. Neuron，2006，49（3）：459-466.
[13] Wang F， Geng X， Tao HY， et al. The restoration after repetitive transcranial magnetic stimulation treatment on cognitive ability of vascular dementia rats and its impacts on synaptic plasticity in hippocampal CA1 area[J]. J Mol Neurosci，2010，41（1）：145-55.
[14] Soares， LM，Schiavon， AP； Milani，et al. Cognitive impairment and persistent anxiety-related responses following bilateral common carotid artery occlusion in mice[J].Behav Brain Res，2013，249：28-37.
[15] Pappas BA de la Torre JC，Davidson CM，et al.Chronic reduction of cerebral blood flow in the adult rat ：late-emerging CA1 cell loss and memory dysfunction [J].Brain Res，1996，708（1-2）：50-58.
[关键词] 血管性痴呆；大鼠；银杏达莫；海马区；学习记忆
中图分类号：R285.5 文献标识码：B 文章编号：2095-5200（2015）06-030-03
DOI：10.11876/mimt201506012
血管性痴呆（Vascular dementia，VD）是指各种脑血管疾病引起脑功能障碍而产生的获得性智能损害综合症，以高级神经认知功能障碍，如学习记忆、认知功能受损等为主要表现，可伴有一系列异常神经心理症状和精神行为，是继阿尔茨海默病之后第二大痴呆疾。VD可以防治，早期治疗，具有可逆性[1-2]。目前，已有文献报道：银杏达莫注射液具有改善脑部微循环、营养神经、清除自由基、抑制神经细胞凋亡，改善由于脑缺血引起症状和记忆功能等功效[3]。银杏达莫注射液对血管性痴呆具有较好临床疗效，但机制研究证据较少。本研究在动物模型上观察银杏达莫注射液对血管性痴呆治疗效果及可能的治疗机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料
实验对象为健康雄性SD大鼠，数量30只，体重在250～300g，SPF级。OPJ-1B型切片机由天津天利航空机电有限公司生产；80i正置显微镜由日本Nikon生产；Morris水迷宫由中国医学科学院药物研究所研制生产。银杏达莫注射液（国药准字H52020032），由贵州益佰制药股份有限公司生产。
1.2 实验方法与分组
SD大鼠经1周适应性饲养，采用Morris水迷宫筛选实验动物，淘汰不能胜任水迷宫大鼠。将符合要求大鼠随机选出20只，改良双侧颈总动脉阻断方法制备血管性痴呆动物模型，余下10只为假手术组，给予相应手术处理但不阻断双侧颈总动脉。手术死亡大鼠剔除实验，并补充相应数目大鼠。术后第2天将造模大鼠，随机分为2组：银杏达莫组给予银杏达莫注射液（剂量为2.7mg/kg）静脉注射 [4]，安慰剂组、假手术组给予等体积生理盐水静脉注射，疗程为2周[5]。治疗结束后，利用Morris水迷宫装置对各组大鼠进行定位航行试验，记录各组大鼠逃避潜伏期。
1.3 制备血管性痴呆动物模型
改良双侧颈总动脉（CAA）阻断法制备血管性痴呆模型[6]。术前12h禁食，10%水合氯醛（350mg/kg体重）腹腔麻醉，取仰卧位，固定于手术台上；行相关手术前准备，颈部正中切口，依次切开皮肤、皮下组织，分离肌肉、血管、神经，充分暴露一侧颈总动脉，给予结扎、剪断该血管；依次缝合肌肉、皮下组织及皮肤。间隔7天后，同样方法再次处理对侧颈总动脉。
1.4 大鼠学习记忆能力测定
利用Morris水迷宫对各组大鼠进行学习记忆评估[7]。定位航行实验（水下任务实验），记录大鼠从入水至爬上平台时间，即逃避潜伏期。逃避潜伏期长短可以客观反映大鼠空间学习记忆能力。连续进行5天定向航行试验，每日4次（上午、下午各2次）。大鼠第5天4次平均逃避潜伏期为该大鼠最终测试时间。
1.5 大鼠脑组织HE切片
大鼠经10%水合氯醛（350mg/Kg）腹腔麻醉，经心脏灌注生理盐水50mL，再用含2%多聚甲醛、1%戊二醛混合液100～250mL灌注固定，时间不超过6min，1h后取脑，每个标本放入4%多聚甲醛PBS溶液中固定4～6h，沿矢状位切成小块，在30%蔗糖溶液中脱水12h后包埋于石蜡中。采用苏木素-伊红（HE染色）脑组织切片，光学显微镜下（×400）观察海马CA1区神经细胞形态及数目。
1.6 统计学处理
应用SPSS18.0统计软件进行相关数据统计学分析，数据用x±s表示。
2 结果
2.1 三组大鼠症状表现
双侧颈总动脉假阻断术后当日大鼠表现为运动减少、进食及饮水较少，之后逐渐恢复。术后2周时假手术组大鼠表现为进食水、活动及精神状态、毛发光泽度恢复至术前水平。安慰剂组表现为大鼠进食、饮水逐渐恢复，目光迟钝，活动量较术前明显减少，毛发脏乱，缺少光泽，对外界刺激反应淡漠。银杏迖莫组大鼠表现为活动量较手术前稍减少、毛发粗糙、欠光泽，对外界反应迟钝。
2.2 大鼠定位航行试验
假手术组平均逃避潜伏期为（12.91±4.86）s；安慰剂组平均逃避潜伏期为（36.92±7.64）s。与假手术组相比，血管痴呆组平均逃避潜伏期明显延长（P<0.05），说明该组SD大鼠出现了学习记忆功能受损。而银杏达莫组大鼠平均逃避潜伏期为（28.23±7.21）s。与安慰剂组相比，银杏达莫组平均逃避潜伏期明显缩短（P<0.05），但与假手术组相比，银杏达莫组平均逃避潜伏期仍延长（P<0.05）。
2.3 银杏达莫对血管性痴呆大鼠海马CA1区神经元
影响
假手术组SD大鼠脑海马CA1区HE染色显示：海马区CA1区神经元细胞呈圆形或椭圆型，细胞核染成淡蓝色，与细胞桨界限清晰，细胞排列紧密，外形规则，呈3～5层排列，未见异常结构（见图A）。安慰剂组大鼠海马CA1区HE染色可见：海马锥体细胞排列紊乱、细胞间隙增大，细胞数目明显减少，细胞核与胞浆分界不清，出现核固缩、变形，可见软化灶、细胞坏死明显（见图B）。银杏达莫组海马区组织切片可见：细胞体积变大，细胞水肿，细胞局部坏死；细胞排列较整齐，可见多层排列轮廓，海马CA1神经元数目、形态较安慰剂组均有明显改善（见图C）。 3 讨论
银杏达莫注射液是以银杏叶提取物为基础复合制剂，主要有效成分为银杏内酯类、银杏黄酮苷、百果内酯、双嘧达莫等；具有改善微循环、抗血小板聚集、清除氧自由基、抑制脂质过氧化等多重药理作用，可以防止细胞内钙离子超载、拮抗谷氨酸等兴奋性氨基酸引起神经毒性[8-9]。大量临床研究发现，银杏达莫注射液对血管性痴呆治疗预防疗效确切，但其治疗血管性痴呆机制尚未阐明[5，10]。本研究通过观察银杏达莫注射液对VD大鼠学习记忆功能及海马CA1区神经细胞影响，探讨VD发病机制和银杏达莫治疗VD作用机制。
本实验采用Morris水迷宫评价大鼠学习和记忆能力，其所测量指标为大鼠逃避潜伏期；逃避潜伏时间越长，学习记忆能力越差。本研究显示：银杏达莫组大鼠平均逃避潜伏期较安慰剂组明显缩短（P<0.05）；但与假手术组相比，银杏迖莫组平均逃避潜伏期仍延长（P<0.05）。因此，该研究表明银杏达莫注射液可以有效改善血管性痴呆大鼠学习记忆能力，但不能使其达到正常大鼠学习记忆水平。
海马作为大脑边缘系统主要组成部分，参与学习、记忆、情绪调节等功能活动，被认为学习记忆关键脑区[11]。临床上，学习记忆受损常是血管性痴呆患者首发和较为突出症状。研究表明，血管性痴呆患者学习记忆受损与海马区神经元变性、坏死、凋亡关系密切[12-15]。本研究也显示：银杏达莫组大鼠海马CA1区神经元细胞较少表现为变性、坏死及凋亡特征，其神经元细胞数目明显多于安慰剂组。海马与动物学习记忆关系最为密切。由此可以推测，银杏达莫改善血管性痴呆大鼠学习记忆能力，其可能通过增强海马区神经元对缺氧耐受、抑制海马区神经元坏死及凋亡、修复损伤神经等多靶点调控机制，从而保护海马区神经元数量及功能。
综上所述，本研究显示：银杏达莫注射液通过对海马CA1区神经细胞保护作用，显著改善VD大鼠学习记忆能力，其可能机制为减轻脑缺血再灌注损伤，抑制海马神经元坏死、凋亡，修复神经损伤。但具体作用机制还有待于进一步研究。
参 考 文 献
[1] Fujihara I，Sadanori S，Abekura H，et al. Relationship between behavioral and psychological symptoms of dementia and oral health status in the elderly with vascular dementia[J]. Gerodontology，2012，30（2）：157-61.
[2] 高康，张庆萍，李飞，等.血管性痴呆早期诊断方法应用进展[J].山东医药，2012，52（26）：90-92.
[3] 高秀菊. 银杏达莫联合吡拉西坦治疗血管性痴呆疗效[J].中国老年学杂志，2012，32（3）：593-594.
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[6] 黄文革，郭芬芬，刘慰华，等.血管性痴呆动物模型制作方法改良[J].中国比较医学杂志，2011，21（5）：49-52.
[7] Schenk F，Morris RG. Dissociation between components of spatial memory in rats after recovery from the effects of retrohippocampal lesions[J]. Exp Brain Res，1985，58（1）：11-28.
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[9] 黄鹤.银杏达莫注射液联合常规西药治疗血管性痴呆疗效评价[J].中医药临床杂志，2013，25（5）：440-443.
[10] Rocher MN，Carré D，Spinnewyn B，et al. Long-term treatment with standardized Ginkgo biloba extract （EGb 761） attenuates cognitive deficits and hippocampal neuron loss in a gerbil model of vascular dementia[J]. Fitoterapia，2011，82（7）：1075-1080.
[11] 张岚，程敬亮. 血管性痴呆大鼠脑血流、行为学和形态学对比及磁共振灌注成像应用价值[J].中国医学影像学杂志，2013，21（7）：485-489.
[12] Wais PE， Wixted JT，Hopkins RO，et al. The Hippocampus supports both the recollection and the familiarity components of recognition memory[J]. Neuron，2006，49（3）：459-466.
[13] Wang F， Geng X， Tao HY， et al. The restoration after repetitive transcranial magnetic stimulation treatment on cognitive ability of vascular dementia rats and its impacts on synaptic plasticity in hippocampal CA1 area[J]. J Mol Neurosci，2010，41（1）：145-55.
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[15] Pappas BA de la Torre JC，Davidson CM，et al.Chronic reduction of cerebral blood flow in the adult rat ：late-emerging CA1 cell loss and memory dysfunction [J].Brain Res，1996，708（1-2）：50-58.