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摘 要：采用响应面法对保加利亚乳杆菌的培养基进行优化，Plackett-Burman （PB）设计对培养基中各因素影响的效应进行评价，结果表明：糖蜜、工业蛋白胨和CaCO3对生物量影响显著。
关键词：保加利亚乳杆菌;培养基优化;响应面
乳酸菌主要存在于畜、禽肠道以及奶制品、酒曲等食品中，其作为微生态制剂还广泛地应用于食品[1]、保健[2，3]和动物饲料等领域;乳酸菌具有抗菌、维持微生态平衡[4]、抑癌和增强免疫力[5]等重要功能，且能赋予食品特殊的风味，是极有价值和开发前景的菌种。因而，研制经济实惠、易收获菌体且活菌数高的增殖培养基是大多研究者共同关心的问题。
在乳酸菌优化培养基研究方面，刘云鹤等[6]通过正交及混料回归试验确定了高效经济的乳酸菌增殖培养基配方，可使发酵液中的乳杆菌和植物乳杆菌的活菌数分别达到 6.02×109 cfu/mL、5.88×109 cfu/mL。付荣霞等[7]通过正交实验研究了几种果蔬汁的添加量、培养时间、黄豆发芽时间对乳酸菌生长的影响，确定了最优的发酵工艺，在此条件下，乳酸菌的菌数为13.8×107 cfu/mL，pH为3.97。本研究在MRS的基础上，对其培养基配方进行了优化，选出了对保加利亚乳杆菌适合规模化生产的发酵培养基，对后期高密度发酵及活性乳酸菌的制备有指导意义。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料
保加利亚乳杆菌：购于中国工业微生物菌种保藏中心（CICC 23764）。
1.1.2 培养基
菌种斜面培养基（MRS培养基）：葡萄糖20.0 g、蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母粉5.0 g、磷酸氢二铵2.0 g、吐温80 1.0 mL、乙酸钠5.0 g、磷酸氢二钾2.0 g、七水硫酸镁0.58 g、一水硫酸锰0.25 g、琼脂20 g、蒸馏水1000 mL，固体培养基中加入2%的琼脂，pH 6.4。
种子培养基、优化前的基础培养基：MRS培养基，250 mL 三角瓶，装量50 mL。
1.2 方法
1.2.1 生物量的测定
细胞OD值的测定：取菌体发酵液5 mL加入10 mL的离心管中，5000 r/min离心10 min，弃上清，沉淀（菌体），再加入5 mL的蒸馏水反复摇匀洗涤，离心弃上清，重复洗涤至无色。稀释后的菌体在600 nm 波长处，用蒸馏水作空白进行测定，OD600nm=OD读数×稀释倍数[8]。
1.2.2 培养基优化
通过单因子试验确定保加利亚乳杆菌培养基的最适碳、氮源，用Design Expert 8.0软件中2水平筛选出影响保加利亚乳杆菌生物量的显著因子，再通过爬坡试验和响应面分析对显著因子的水平进行优化[9]。
2 结果与分析
2.1 Plackett-Burman试验设计与分析
考虑到实际生产中的原料成本及来源，选定糖蜜、工业蛋白胨进行单因素优化预试验，确定其最佳浓度分别为150 mL/L和3%（资料未显示）。
用Design Expert按Plackett-Burman实验设计进行实验，将各个因素设计成高 （+1） 和低 （-1） 2个水平，高水平是低水平的1.25倍。
Plackett-Burman实验设计每组的实验结果，根据此结果进行显著性分析，糖蜜、酵母粉、工业蛋白胨、磷酸氢二钾、一水硫酸锰和磷酸氢氨表现为正效应，七水硫酸镁和碳酸钙表现为负效应。糖蜜、工业蛋白胨、酵母粉、碳酸钙的P值分别为0.0248、0.0160、0.0277、0.0261，可信度均大于95%，表现为显著。工业蛋白胨的浓度对乳酸菌生物量影响最大，其次是糖蜜和碳酸钙。因此确定工业蛋白胨、糖蜜、碳酸钙为主要影响因素，进行下一步实验。
2.2 响应面分析的试验设计及结果
根据最陡爬坡实验确定了显著因素浓度的取值区间。利用Design Expert进行中心组合的实验设计，将最陡爬坡试验的3 个因素糖蜜、工业蛋白胨和碳酸钙分别标记为X1、X2、X3，以发酵10 h后的OD值作为响应值，记为Y，各变量水平见表4，实验结果见表5。根据表5的实验结果通过Design Expert进行显著性分析，建立多元二次回归方程：
Y=6.53+0.033X1+0.12X2-0.034X3+0.016X1X2-0.16X1X3-0.034X2X3-0.11X12-0.12X22-0.14X32
方程的方差分析结果，模型大于F值的概率P<0.01，表明模型非常显著，对响应值Y的影响非常显著，可信度较高;模型失拟项的P值为0.1251，不显著，决定系数R2=0.9162，说明因变量与考察的自变量之间的线性关系显著;综上所述，使用该模型可以较好的对响应值进行分析和预测。
2.4 最佳浓度的确定及验证试验
根据上述回归方程，以确认糖蜜、工业蛋白胨、碳酸钙3个因素对乳酸菌生物量的影响，3个因素两两相互作用的图像开口均是向下的，说明可以由拟合方程求出预测的生物量的最大值。由Design Expert软件分析得到最适培养基组成为糖蜜180 mL/L，工业蛋白胨3.52%，碳酸钙0.15%，酵母浸粉3%、磷酸氢二钾0.2%、七水硫酸镁0.15%、轻质碳酸钙0.1%、一水硫酸锰0.002%、磷酸氢氨0.15%。预测在此组成条件下，乳酸菌生物量最大，OD600nm值为6.50。
参考文献：
[1] 杨洁彬. 乳酸菌[M]. 轻工业出版社， 1996.
[2] 陈杰， 徐冲， 孙翠焕，等. 乳酸菌在食品工业中的应用现状及发展前景[J]. 微生物学杂志， 2012， 32（3）：91-94.
[3] 田永峰， 吴天祥， 胡晓瑜，等. 乳酸菌在酿造和食品工業上的应用[J]. 酿酒科技， 2007（4）：90-93.
[4] 赵龙飞. 乳酸菌的保健功能及其在食品中的应用研究[J]. 中国调味品， 2009， 34（6）：30-33.
[5] 张金桃， 周传云， 侯爱香. 乳酸菌的保健功能及其保健机理的研究[C]// 益生元国际论坛. 2007.
[6] 刘云鹤. 高效乳酸菌增殖培养基的筛选[J]. 淮海工学院学报.自然科学版， 2003， 12（4）：59-62.
[7] 付荣霞， 鲍雅楠， 崔艳，等. 几种果蔬汁对乳酸菌增殖的影响[J]. 贵州农业科学， 2012， 40（6）：187-189.
[8] Romanos M A， Scorer C A， Clare J J. Foreign gene expression in yeast： a review[J]. Yeast， 1992， 8（6）： 423-488.
[9] Velly H， Fonseca F， Passot S， et al. Cell growth and resistance of Lactococcus lactis subsp. lactis TOMSC161 following freezing， drying and freeze-dried storage are differentially affected by fermentation conditions[J]. Journal of Applied Microbiology， 2014， 117（3）： 729-740.
关键词：保加利亚乳杆菌;培养基优化;响应面
乳酸菌主要存在于畜、禽肠道以及奶制品、酒曲等食品中，其作为微生态制剂还广泛地应用于食品[1]、保健[2，3]和动物饲料等领域;乳酸菌具有抗菌、维持微生态平衡[4]、抑癌和增强免疫力[5]等重要功能，且能赋予食品特殊的风味，是极有价值和开发前景的菌种。因而，研制经济实惠、易收获菌体且活菌数高的增殖培养基是大多研究者共同关心的问题。
在乳酸菌优化培养基研究方面，刘云鹤等[6]通过正交及混料回归试验确定了高效经济的乳酸菌增殖培养基配方，可使发酵液中的乳杆菌和植物乳杆菌的活菌数分别达到 6.02×109 cfu/mL、5.88×109 cfu/mL。付荣霞等[7]通过正交实验研究了几种果蔬汁的添加量、培养时间、黄豆发芽时间对乳酸菌生长的影响，确定了最优的发酵工艺，在此条件下，乳酸菌的菌数为13.8×107 cfu/mL，pH为3.97。本研究在MRS的基础上，对其培养基配方进行了优化，选出了对保加利亚乳杆菌适合规模化生产的发酵培养基，对后期高密度发酵及活性乳酸菌的制备有指导意义。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料
保加利亚乳杆菌：购于中国工业微生物菌种保藏中心（CICC 23764）。
1.1.2 培养基
菌种斜面培养基（MRS培养基）：葡萄糖20.0 g、蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母粉5.0 g、磷酸氢二铵2.0 g、吐温80 1.0 mL、乙酸钠5.0 g、磷酸氢二钾2.0 g、七水硫酸镁0.58 g、一水硫酸锰0.25 g、琼脂20 g、蒸馏水1000 mL，固体培养基中加入2%的琼脂，pH 6.4。
种子培养基、优化前的基础培养基：MRS培养基，250 mL 三角瓶，装量50 mL。
1.2 方法
1.2.1 生物量的测定
细胞OD值的测定：取菌体发酵液5 mL加入10 mL的离心管中，5000 r/min离心10 min，弃上清，沉淀（菌体），再加入5 mL的蒸馏水反复摇匀洗涤，离心弃上清，重复洗涤至无色。稀释后的菌体在600 nm 波长处，用蒸馏水作空白进行测定，OD600nm=OD读数×稀释倍数[8]。
1.2.2 培养基优化
通过单因子试验确定保加利亚乳杆菌培养基的最适碳、氮源，用Design Expert 8.0软件中2水平筛选出影响保加利亚乳杆菌生物量的显著因子，再通过爬坡试验和响应面分析对显著因子的水平进行优化[9]。
2 结果与分析
2.1 Plackett-Burman试验设计与分析
考虑到实际生产中的原料成本及来源，选定糖蜜、工业蛋白胨进行单因素优化预试验，确定其最佳浓度分别为150 mL/L和3%（资料未显示）。
用Design Expert按Plackett-Burman实验设计进行实验，将各个因素设计成高 （+1） 和低 （-1） 2个水平，高水平是低水平的1.25倍。
Plackett-Burman实验设计每组的实验结果，根据此结果进行显著性分析，糖蜜、酵母粉、工业蛋白胨、磷酸氢二钾、一水硫酸锰和磷酸氢氨表现为正效应，七水硫酸镁和碳酸钙表现为负效应。糖蜜、工业蛋白胨、酵母粉、碳酸钙的P值分别为0.0248、0.0160、0.0277、0.0261，可信度均大于95%，表现为显著。工业蛋白胨的浓度对乳酸菌生物量影响最大，其次是糖蜜和碳酸钙。因此确定工业蛋白胨、糖蜜、碳酸钙为主要影响因素，进行下一步实验。
2.2 响应面分析的试验设计及结果
根据最陡爬坡实验确定了显著因素浓度的取值区间。利用Design Expert进行中心组合的实验设计，将最陡爬坡试验的3 个因素糖蜜、工业蛋白胨和碳酸钙分别标记为X1、X2、X3，以发酵10 h后的OD值作为响应值，记为Y，各变量水平见表4，实验结果见表5。根据表5的实验结果通过Design Expert进行显著性分析，建立多元二次回归方程：
Y=6.53+0.033X1+0.12X2-0.034X3+0.016X1X2-0.16X1X3-0.034X2X3-0.11X12-0.12X22-0.14X32
方程的方差分析结果，模型大于F值的概率P<0.01，表明模型非常显著，对响应值Y的影响非常显著，可信度较高;模型失拟项的P值为0.1251，不显著，决定系数R2=0.9162，说明因变量与考察的自变量之间的线性关系显著;综上所述，使用该模型可以较好的对响应值进行分析和预测。
2.4 最佳浓度的确定及验证试验
根据上述回归方程，以确认糖蜜、工业蛋白胨、碳酸钙3个因素对乳酸菌生物量的影响，3个因素两两相互作用的图像开口均是向下的，说明可以由拟合方程求出预测的生物量的最大值。由Design Expert软件分析得到最适培养基组成为糖蜜180 mL/L，工业蛋白胨3.52%，碳酸钙0.15%，酵母浸粉3%、磷酸氢二钾0.2%、七水硫酸镁0.15%、轻质碳酸钙0.1%、一水硫酸锰0.002%、磷酸氢氨0.15%。预测在此组成条件下，乳酸菌生物量最大，OD600nm值为6.50。
参考文献：
[1] 杨洁彬. 乳酸菌[M]. 轻工业出版社， 1996.
[2] 陈杰， 徐冲， 孙翠焕，等. 乳酸菌在食品工业中的应用现状及发展前景[J]. 微生物学杂志， 2012， 32（3）：91-94.
[3] 田永峰， 吴天祥， 胡晓瑜，等. 乳酸菌在酿造和食品工業上的应用[J]. 酿酒科技， 2007（4）：90-93.
[4] 赵龙飞. 乳酸菌的保健功能及其在食品中的应用研究[J]. 中国调味品， 2009， 34（6）：30-33.
[5] 张金桃， 周传云， 侯爱香. 乳酸菌的保健功能及其保健机理的研究[C]// 益生元国际论坛. 2007.
[6] 刘云鹤. 高效乳酸菌增殖培养基的筛选[J]. 淮海工学院学报.自然科学版， 2003， 12（4）：59-62.
[7] 付荣霞， 鲍雅楠， 崔艳，等. 几种果蔬汁对乳酸菌增殖的影响[J]. 贵州农业科学， 2012， 40（6）：187-189.
[8] Romanos M A， Scorer C A， Clare J J. Foreign gene expression in yeast： a review[J]. Yeast， 1992， 8（6）： 423-488.
[9] Velly H， Fonseca F， Passot S， et al. Cell growth and resistance of Lactococcus lactis subsp. lactis TOMSC161 following freezing， drying and freeze-dried storage are differentially affected by fermentation conditions[J]. Journal of Applied Microbiology， 2014， 117（3）： 729-740.