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摘要：从雪胆多种组织中分离、筛选出抗MRSA的菌株，采用总DNA ERIC-PCR方法和16S rRNA基因全序列分析方法，对抗MRSA的雪胆内生细菌进行遗传多样性和系统发育分析。结果表明，雪胆内生细菌非常丰富，分离获得25株抗MRSA菌株。在遗传距离为0.50时，25株菌被划分为4个ERIC群和1个独立成群的菌株。
关键词：雪胆；内生细菌；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；多样性
中图分类号：S567.23+9.01文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）02-303-03
收稿日期：2013-06-07
基金项目：四川省教育厅科研项目（编号：12ZA240）；乐山师范学院科研项目（编号：Z1160）。
作者简介：康琳（1990—），女，本科生，从事微生物资源研究。E-mail：947531778@qq.com。
通信作者：龚明福，教授，博士，从事微生物资源及微生物与植物间相互关系研究。E-mail：gongmingfu98@163.com。雪胆（Hemsleya sinesis Cogn.） 为葫芦科雪胆属植物，含多种活性成分，具有多种药理作用，包括抗肿瘤[1]、改善微循环、广谱抗菌[2]、抗病毒[3]、保护肝脏[4]、治疗胃肠疾病[5]、降温[2]、抗炎镇咳[6]等作用，被广泛应用于临床，是一种具有发展前景的中药[7]。目前，对雪胆的研究取得了一定进展，如雪胆有效成分的提取工艺、作用机制、检测方法的建立等。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）为医院内感染的多重耐药性病原菌[8]，只对万古霉素敏感[9]，目前几乎所有国家都已有MRSA的报道，我国各大医院MRSA的分离率也很高[10]，近年来在全世界蔓延的速度比较快。MRSA除对甲氧西林耐药外，还对临床上广泛应用的多种抗生素耐药，导致感染呈散发性或暴发性流行，成为全世界范围抗细菌感染中的难题，已引起医药界专家与制药企业高度关注，因此，解决MRSA耐药性问题，即研发新的抗MRSA药物已经成为当今非常重要的任务。根据相似性原理，生活在药用植物组织中的内生细菌能产生与药用植物相似的活性成分。刘佳等筛选到1株具有抗MRSA活性的枯草芽孢杆菌，该菌产生的胞外抑菌物质对MRSA具有较好的抑制效果[11]。雪胆抗菌谱广，其内生细菌具有抗MRSA的潜力，因此从雪胆内生细菌中筛选抗MRSA菌株并通过发酵生产抗MRSA药物具有重要的意义和发展潜力。
1材料与方法
1.1培养基
NA培养基：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、琼脂 18 g、水1 000 mL，pH值 7.2～7.4；PDA培养基：马铃薯 200 g、葡萄糖20 g、琼脂18 g、水1 000 mL，pH值自然，121 ℃灭菌30 min。
1.2雪胆内生细菌的分离纯化
从峨眉山采集生长健康的雪胆，从其根茎组织中分离内生细菌。将待分离的新鲜雪胆根茎组织用自来水冲洗干净，并称取样品1 g，先用75%乙醇浸泡消毒5 min，再用2%次氯酸钠进行表面消毒5 min，最后用无菌水冲洗3～5次；冲洗干净之后，每种样品中加入10 mL无菌水，放在无菌研钵中研磨，静置20 min，取上清液按倍比稀释法系列稀释1 000倍后，取梯度稀释液0.1 mL涂布于平板上，每个处理重复3次，于28 ℃下暗培养72 h；最后一次冲洗的无菌水涂布在NA培养基上，于28 ℃下暗培养72 h，观察是否有菌落长出，进行无菌检验。
等菌落长出后观察菌落形态和菌体形态（包括大小、形状、颜色、表面光泽、透明度、质地、革兰氏染色反应、有无芽孢等），分别挑取不同的菌落，然后在培养基平板上纯化，将纯化后的内生细菌用相应的培养基斜面及甘油管于4 ℃冰箱内保存备用。
1.3抗MRSA内生细菌的筛选
1.3.1初筛在平板表面涂布MRSA，晾干，取活化的内生细菌菌液一环点接到NA平板上；取无菌水代替内生细菌菌液点接到涂有指示菌MRSA的NA平板上培养，作为空白对照，每个处理重复3次。将平板置于37 ℃培养箱中培养 24 h，测定抑菌圈直径并记录试验结果。
1.3.2复筛在平板表面涂布MRSA，晾干，然后在平板上距离平板中心1.5 cm处放入牛津杯，吸取100 μL初筛的具有抑菌作用的内生细菌发酵液，加入到牛津杯中，用万古霉素代替内生细菌菌液作为阳性对照，每处理重复3次。将平板置于37 ℃培养箱中培养24 h，测量抑菌圈直径。
1.4拮抗性雪胆内生细菌ERIC-PCR分析
拮抗性内生细菌基因组总DNA的提取方法参见徐琳等的方法[12]，特异性引物选取ERIC1R（5′-ATGTAAGCTCCCTGGGGATTCAC-3′）和ERIC2L（5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′）[13]，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。反应总体系为25 μL，其组成为 10×Buffer 2.5 μL、25 mmol/μL MgCl2 2.0 μL、2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL、20 pmol/μL ERIC1R 0.5 μL、20 pmol/μL ERIC2L 0.5 μL、13 μL ddH2O、模板总DNA（40～80 ng/μL）4.0 μL。ERIC-PCR反应程序参照马溪平等的方法[13]。反应结束后取出PCR小管，用1%琼脂糖凝胶电泳3.5 h，利用凝胶成像系统仪拍照并保存图谱，凝胶图像经电脑扫描处理后，在同一位置有带的记为“1”，没有的记为“0”。采用DPS软件，用遗传距离按类平均连锁聚类法（UPGMA）进行0-1系统聚类分析，得出树状图[14]。 2结果与分析
2.1雪胆内生细菌的分离
将采集到的雪胆进行内生细菌分离，结果发现，在NA平板上长出大量菌落，且菌落形态存在明显差异，共得到30株内生细菌，依次编号为KLXD01～KLXD30，这表明雪胆组织中存在大量的内生细菌。
2.2抗MRSA内生细菌的筛选
采用平板对峙法初筛、牛津杯法复筛，从所分离到的30株内生细菌中共筛选出25株对MRSA具有抑制效果的菌株（表1），不同细菌菌株的抑菌效果存在明显差异，KLXD06、KLXD17、KLXD21、KLXD24等4株菌抗MRSA的效果较好，其中KLXD06抗MRSA最大，抑菌圈直径达19.3 mm。
2.3拮抗性雪胆内生细菌ERIC-PCR分析
对25株拮抗性雪胆内生细菌进行ERIC-PCR扩增，结果表明，供试菌株ERIC-PCR图谱多呈现3～5条条带，其分布各不相同，其大小范围100～1 500 bp（图1），说明不同菌株在分子水平上存在差异。
用DPS软件系统采用类平均连锁法（UPGMA）对这些菌株的ERIC-PCR结果进行聚类分析，得到树状图（图2）。从图2可以看出，在遗传距离为0.71时，所有供试菌株聚在一起；在遗传距离为0.50时，供试菌株进一步被划分为4个ERIC群和1个独立成群的菌株，4个ERIC群分别命名为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ，每个群的菌株数依次为6、8、5、5株，中心菌株分别为KLXD01、KLXD08、KLXD12、KLXD10。
3结论与讨论
雪胆植物内生细菌非常丰富，笔者从雪胆中分离到30株内生细菌。ERIC-PCR结果显示，具有抗MRSA活性的25株菌株在遗传距离为0.50时被分为4个ERIC群和1个独立成群。
目前，我国以采用体外抑菌法从中草药及其提取物中筛
选抗MRSA的物质为主，其中黄岑、黄连等表现出较好的抑菌效果[15-17]，但中草药成分复杂，分析其抑菌机制比较困难。多株已筛选出的放线菌对MRSA具有较好的抑制效果[11，18-19]。张守村等从苦豆子内生细菌中筛选到1株抗MRSA活性较强的菌株[20]。从其他药用植物内生细菌中筛选抗MRSA菌株还鲜见报道。雪胆抗菌谱广，其内生细菌抗MRSA活性强，笔者从雪胆中分离到30株内生细菌，有25株菌株具有较强的抗MRSA活性，其中雪胆内生细菌KLXD06的抗MRSA活性最强，有生产抗MRSA活性药物的潜力，但该菌株的系统发育地位还需要进一步确定。
参考文献：
[1]陶朝阳，易杨华，林厚文，等. 雪胆根抗肿瘤活性成分研究[J]. 第二军医大学学报，1999，20（5）：337-338.
[2]李亮，朱玲，刘蓉，等. 雪胆素的药效学试验[J]. 四川生理科学杂志，2005，27（3）：135.
[3]田仁荣，陈剑超，张高红，等. 雪胆素A和B的体外抗HIV-1活性：英文[J]. 中国天然药物，2008，6（3）：214-218.
[4]施亚琴，杨培全，台云梅，等. 反相高效液相色谱法测定不同采收期长果雪胆中雪胆甲素的含量[J]. 中国中药杂志，1996（5）：20-21.
[5]刘艳丽，李笑然，范金胤，等. 雪胆胃肠丸对胃溃疡的作用实验研究[J]. 时珍国医国药，2010，21（2）：301-302.
[6]陈夏静，伍怡颖，匡文娟，等. 雪胆素片抗炎镇咳作用的实验研究[J]. 四川生理科学杂志，2009，31（4）：153-154.
[7]杨群芳，王贤英. 中药雪胆及其制剂的研究进展[J]. 中国药业，2003，12（9）：76-77.
[8]Hiramatsu K，Katayama Y，Yuzawa H，et al. Molecular genetics of methicillin-resistant Staphylococcus aureus[J]. International Journal of Medical Microbiology，2002，292（2）：67-74.
[9]Liares J. The VISA/GISA problem：therapeutic implications[J]. Clin Microbiol Infect，2001，7（Suppl）：8-15.
[10]张小青，易婷，林春婵，等. 医院感染现患率调查与分析[J]. 中华医院感染学杂志，2005，15（12）：1352-1354.
[11]刘佳，谢秀丽，牛天贵. 一株抑耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）芽孢杆菌的筛选与鉴定[J]. 中国农业大学学报，2007，12（6）：20-23.
[12]徐琳，徐佳洁，刘巧莉，等. 西北部分地区苦马豆根瘤菌的遗传多样性[J]. 生物多样性，2009，17（1）：69-75.
[13]马溪平，邱媛，徐成斌，等. 制药废水处理系统微生物群落动态变化的ERIC-PCR指纹图谱分析[J]. 辽宁大学学报：自然科学版，2008，35（2）：158-161.
[14]唐启义，冯明光. DPS 数据处理系统：实验设计、统计分析及数据挖掘[M]. 北京：科学出版社，2007.
[15]汪雅萍，陈同钧. 十一种中草药对细菌的体外抑菌作用分析[J]. 上海医学检验杂志，1999，14（4）：206-207.
[16]杨明炜，陆付耳，徐丽君，等. 20种清热解毒中药对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌体外抑菌的初步观察[J]. 中国药师，2006，9（2）：141-142.
[17]左国营，王根春，徐贵丽，等. 30种中草药提取物体外抗MRSA的筛选研究[J]. 中国现代应用药学，2006，23（4）：293-295.
[18]黄惠琴，吕家森，张开山，等. 一株抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的海洋放线菌的鉴定及系统发育分析[J]. 中国海洋药物，2004，23（6）：23-26.
[19]高正航. 霸王岭土壤抗MRSA活性放线菌的筛选及菌株Gda031、Gda0305发酵工艺的优化[D]. 儋州：华南热带农业大学，2006.
[20]张守村，韩松，黄晓艳，等. 一株抗MRSA内生细菌的鉴定及其活性物质的初步研究[J]. 微生物学通报，2011，38（6）：860-864.
关键词：雪胆；内生细菌；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；多样性
中图分类号：S567.23+9.01文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）02-303-03
收稿日期：2013-06-07
基金项目：四川省教育厅科研项目（编号：12ZA240）；乐山师范学院科研项目（编号：Z1160）。
作者简介：康琳（1990—），女，本科生，从事微生物资源研究。E-mail：947531778@qq.com。
通信作者：龚明福，教授，博士，从事微生物资源及微生物与植物间相互关系研究。E-mail：gongmingfu98@163.com。雪胆（Hemsleya sinesis Cogn.） 为葫芦科雪胆属植物，含多种活性成分，具有多种药理作用，包括抗肿瘤[1]、改善微循环、广谱抗菌[2]、抗病毒[3]、保护肝脏[4]、治疗胃肠疾病[5]、降温[2]、抗炎镇咳[6]等作用，被广泛应用于临床，是一种具有发展前景的中药[7]。目前，对雪胆的研究取得了一定进展，如雪胆有效成分的提取工艺、作用机制、检测方法的建立等。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）为医院内感染的多重耐药性病原菌[8]，只对万古霉素敏感[9]，目前几乎所有国家都已有MRSA的报道，我国各大医院MRSA的分离率也很高[10]，近年来在全世界蔓延的速度比较快。MRSA除对甲氧西林耐药外，还对临床上广泛应用的多种抗生素耐药，导致感染呈散发性或暴发性流行，成为全世界范围抗细菌感染中的难题，已引起医药界专家与制药企业高度关注，因此，解决MRSA耐药性问题，即研发新的抗MRSA药物已经成为当今非常重要的任务。根据相似性原理，生活在药用植物组织中的内生细菌能产生与药用植物相似的活性成分。刘佳等筛选到1株具有抗MRSA活性的枯草芽孢杆菌，该菌产生的胞外抑菌物质对MRSA具有较好的抑制效果[11]。雪胆抗菌谱广，其内生细菌具有抗MRSA的潜力，因此从雪胆内生细菌中筛选抗MRSA菌株并通过发酵生产抗MRSA药物具有重要的意义和发展潜力。
1材料与方法
1.1培养基
NA培养基：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、琼脂 18 g、水1 000 mL，pH值 7.2～7.4；PDA培养基：马铃薯 200 g、葡萄糖20 g、琼脂18 g、水1 000 mL，pH值自然，121 ℃灭菌30 min。
1.2雪胆内生细菌的分离纯化
从峨眉山采集生长健康的雪胆，从其根茎组织中分离内生细菌。将待分离的新鲜雪胆根茎组织用自来水冲洗干净，并称取样品1 g，先用75%乙醇浸泡消毒5 min，再用2%次氯酸钠进行表面消毒5 min，最后用无菌水冲洗3～5次；冲洗干净之后，每种样品中加入10 mL无菌水，放在无菌研钵中研磨，静置20 min，取上清液按倍比稀释法系列稀释1 000倍后，取梯度稀释液0.1 mL涂布于平板上，每个处理重复3次，于28 ℃下暗培养72 h；最后一次冲洗的无菌水涂布在NA培养基上，于28 ℃下暗培养72 h，观察是否有菌落长出，进行无菌检验。
等菌落长出后观察菌落形态和菌体形态（包括大小、形状、颜色、表面光泽、透明度、质地、革兰氏染色反应、有无芽孢等），分别挑取不同的菌落，然后在培养基平板上纯化，将纯化后的内生细菌用相应的培养基斜面及甘油管于4 ℃冰箱内保存备用。
1.3抗MRSA内生细菌的筛选
1.3.1初筛在平板表面涂布MRSA，晾干，取活化的内生细菌菌液一环点接到NA平板上；取无菌水代替内生细菌菌液点接到涂有指示菌MRSA的NA平板上培养，作为空白对照，每个处理重复3次。将平板置于37 ℃培养箱中培养 24 h，测定抑菌圈直径并记录试验结果。
1.3.2复筛在平板表面涂布MRSA，晾干，然后在平板上距离平板中心1.5 cm处放入牛津杯，吸取100 μL初筛的具有抑菌作用的内生细菌发酵液，加入到牛津杯中，用万古霉素代替内生细菌菌液作为阳性对照，每处理重复3次。将平板置于37 ℃培养箱中培养24 h，测量抑菌圈直径。
1.4拮抗性雪胆内生细菌ERIC-PCR分析
拮抗性内生细菌基因组总DNA的提取方法参见徐琳等的方法[12]，特异性引物选取ERIC1R（5′-ATGTAAGCTCCCTGGGGATTCAC-3′）和ERIC2L（5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′）[13]，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。反应总体系为25 μL，其组成为 10×Buffer 2.5 μL、25 mmol/μL MgCl2 2.0 μL、2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL、20 pmol/μL ERIC1R 0.5 μL、20 pmol/μL ERIC2L 0.5 μL、13 μL ddH2O、模板总DNA（40～80 ng/μL）4.0 μL。ERIC-PCR反应程序参照马溪平等的方法[13]。反应结束后取出PCR小管，用1%琼脂糖凝胶电泳3.5 h，利用凝胶成像系统仪拍照并保存图谱，凝胶图像经电脑扫描处理后，在同一位置有带的记为“1”，没有的记为“0”。采用DPS软件，用遗传距离按类平均连锁聚类法（UPGMA）进行0-1系统聚类分析，得出树状图[14]。 2结果与分析
2.1雪胆内生细菌的分离
将采集到的雪胆进行内生细菌分离，结果发现，在NA平板上长出大量菌落，且菌落形态存在明显差异，共得到30株内生细菌，依次编号为KLXD01～KLXD30，这表明雪胆组织中存在大量的内生细菌。
2.2抗MRSA内生细菌的筛选
采用平板对峙法初筛、牛津杯法复筛，从所分离到的30株内生细菌中共筛选出25株对MRSA具有抑制效果的菌株（表1），不同细菌菌株的抑菌效果存在明显差异，KLXD06、KLXD17、KLXD21、KLXD24等4株菌抗MRSA的效果较好，其中KLXD06抗MRSA最大，抑菌圈直径达19.3 mm。
2.3拮抗性雪胆内生细菌ERIC-PCR分析
对25株拮抗性雪胆内生细菌进行ERIC-PCR扩增，结果表明，供试菌株ERIC-PCR图谱多呈现3～5条条带，其分布各不相同，其大小范围100～1 500 bp（图1），说明不同菌株在分子水平上存在差异。
用DPS软件系统采用类平均连锁法（UPGMA）对这些菌株的ERIC-PCR结果进行聚类分析，得到树状图（图2）。从图2可以看出，在遗传距离为0.71时，所有供试菌株聚在一起；在遗传距离为0.50时，供试菌株进一步被划分为4个ERIC群和1个独立成群的菌株，4个ERIC群分别命名为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ，每个群的菌株数依次为6、8、5、5株，中心菌株分别为KLXD01、KLXD08、KLXD12、KLXD10。
3结论与讨论
雪胆植物内生细菌非常丰富，笔者从雪胆中分离到30株内生细菌。ERIC-PCR结果显示，具有抗MRSA活性的25株菌株在遗传距离为0.50时被分为4个ERIC群和1个独立成群。
目前，我国以采用体外抑菌法从中草药及其提取物中筛
选抗MRSA的物质为主，其中黄岑、黄连等表现出较好的抑菌效果[15-17]，但中草药成分复杂，分析其抑菌机制比较困难。多株已筛选出的放线菌对MRSA具有较好的抑制效果[11，18-19]。张守村等从苦豆子内生细菌中筛选到1株抗MRSA活性较强的菌株[20]。从其他药用植物内生细菌中筛选抗MRSA菌株还鲜见报道。雪胆抗菌谱广，其内生细菌抗MRSA活性强，笔者从雪胆中分离到30株内生细菌，有25株菌株具有较强的抗MRSA活性，其中雪胆内生细菌KLXD06的抗MRSA活性最强，有生产抗MRSA活性药物的潜力，但该菌株的系统发育地位还需要进一步确定。
参考文献：
[1]陶朝阳，易杨华，林厚文，等. 雪胆根抗肿瘤活性成分研究[J]. 第二军医大学学报，1999，20（5）：337-338.
[2]李亮，朱玲，刘蓉，等. 雪胆素的药效学试验[J]. 四川生理科学杂志，2005，27（3）：135.
[3]田仁荣，陈剑超，张高红，等. 雪胆素A和B的体外抗HIV-1活性：英文[J]. 中国天然药物，2008，6（3）：214-218.
[4]施亚琴，杨培全，台云梅，等. 反相高效液相色谱法测定不同采收期长果雪胆中雪胆甲素的含量[J]. 中国中药杂志，1996（5）：20-21.
[5]刘艳丽，李笑然，范金胤，等. 雪胆胃肠丸对胃溃疡的作用实验研究[J]. 时珍国医国药，2010，21（2）：301-302.
[6]陈夏静，伍怡颖，匡文娟，等. 雪胆素片抗炎镇咳作用的实验研究[J]. 四川生理科学杂志，2009，31（4）：153-154.
[7]杨群芳，王贤英. 中药雪胆及其制剂的研究进展[J]. 中国药业，2003，12（9）：76-77.
[8]Hiramatsu K，Katayama Y，Yuzawa H，et al. Molecular genetics of methicillin-resistant Staphylococcus aureus[J]. International Journal of Medical Microbiology，2002，292（2）：67-74.
[9]Liares J. The VISA/GISA problem：therapeutic implications[J]. Clin Microbiol Infect，2001，7（Suppl）：8-15.
[10]张小青，易婷，林春婵，等. 医院感染现患率调查与分析[J]. 中华医院感染学杂志，2005，15（12）：1352-1354.
[11]刘佳，谢秀丽，牛天贵. 一株抑耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）芽孢杆菌的筛选与鉴定[J]. 中国农业大学学报，2007，12（6）：20-23.
[12]徐琳，徐佳洁，刘巧莉，等. 西北部分地区苦马豆根瘤菌的遗传多样性[J]. 生物多样性，2009，17（1）：69-75.
[13]马溪平，邱媛，徐成斌，等. 制药废水处理系统微生物群落动态变化的ERIC-PCR指纹图谱分析[J]. 辽宁大学学报：自然科学版，2008，35（2）：158-161.
[14]唐启义，冯明光. DPS 数据处理系统：实验设计、统计分析及数据挖掘[M]. 北京：科学出版社，2007.
[15]汪雅萍，陈同钧. 十一种中草药对细菌的体外抑菌作用分析[J]. 上海医学检验杂志，1999，14（4）：206-207.
[16]杨明炜，陆付耳，徐丽君，等. 20种清热解毒中药对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌体外抑菌的初步观察[J]. 中国药师，2006，9（2）：141-142.
[17]左国营，王根春，徐贵丽，等. 30种中草药提取物体外抗MRSA的筛选研究[J]. 中国现代应用药学，2006，23（4）：293-295.
[18]黄惠琴，吕家森，张开山，等. 一株抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的海洋放线菌的鉴定及系统发育分析[J]. 中国海洋药物，2004，23（6）：23-26.
[19]高正航. 霸王岭土壤抗MRSA活性放线菌的筛选及菌株Gda031、Gda0305发酵工艺的优化[D]. 儋州：华南热带农业大学，2006.
[20]张守村，韩松，黄晓艳，等. 一株抗MRSA内生细菌的鉴定及其活性物质的初步研究[J]. 微生物学通报，2011，38（6）：860-864.