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摘要：为初步明确大豆田反枝苋对咪唑乙烟酸的抗药性水平，并从分子角度对抗药性机制进行解释，以我国四川成都和黑龙江嫩江采集的反枝苋种子为材料，通过琼脂法检测了反枝苋对咪唑乙烟酸的抗药性水平，并分别对R（嫩江抗性种群）和S（成都敏感种群）的乙酰乳酸合成酶（ALS）部分序列进行扩增和测序。皿内生测结果表明，成都种群的GI50为11.20，嫩江种群的GI50为52.26，其抗药性指数RI为4.67。分子检测结果表明，与S种群相比，R种群反枝苋ALS位于高度保守区Domain B编码574位氨基酸的基因发生突变，TGG突变为TTG，导致色氨酸被亮氨酸取代。ALS保守区域氨基酸的替换可能是嫩江反枝苋种群对咪唑乙烟酸产生抗性的重要原因之一。
关键词：反枝苋； 咪唑乙烟酸； 抗药性； 突变
中图分类号： S 481.4
文献标识码： A
反枝苋（Amaranthus retroflexus L.），英文名为redroot pigweed，别名为西风谷、野米谷等，是我国农田、果园常见的一年生苋科阔叶杂草。反枝苋于19世纪40年代入侵我国，因产籽量大、适应性强的特点而广泛分布，在我国暖温带危害面积达36%[13]，在世界多地被列为恶性杂草。咪唑乙烟酸，商品名为普施特，是20世纪80年代美国氰胺公司开发的咪唑啉酮类除草剂优秀品种， 作用靶标为乙酰乳酸合成酶（ALS），目前广泛应用于大豆田化学除草。针对其残留特点，目前已成功开发了抗咪唑啉酮类作物如玉米、油菜、小麦、水稻等，扩大了该类除草剂的应用范围[4]。乙酰乳酸合成酶，又名乙酰羟酸合成酶，是由细胞核编码的叶绿体酶。它是控制植物体内合成支链氨基酸（亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸）公共途径的关键酶，为磺酰脲类、咪唑啉酮类等多种高效低毒除草剂的靶标酶。
世界范围内已对ALS抑制剂抗药性进行了很多报道。目前已发现的144种ALS抑制剂抗药性杂草中，共有8个ALS基因位点突变的发生经证实与抗药性产生直接相关[57]。这些位点在拟南芥ALS氨基酸序列中相应的位置及表达的氨基酸分别为第122 位丙氨酸（Ala122），第197位脯氨酸（Pro197），第205位丙氨酸（Ala205），第376位天冬氨酸（Asp376），第377位精氨酸（Arg377），第574位色氨酸（Trp574），第653位丝氨酸（Ser653）和第654位甘氨酸（Gly654）。高等植物ALS氨基酸序列有5个不连续的高度保守区，分别为Domain C、Domain A、Domain D、Domain B 和 Domain E。其中，A122位于Domain C；P197位于Domain A；A205位于Domain D；W574位于Domain B；S653位于Domain E。
国外最早于1980年分别在加拿大、法国、德国和美国的农田发现了抗莠去津的反枝苋。我国于1990年在黑龙江的多个地块也发现了抗莠去津的反枝苋[8]，另外抗氯嘧磺隆的反枝苋也在辽宁省有发现[9]。但我国反枝苋抗药性及其机理尚未明确。本研究旨在初步明确我国黑龙江大豆田反枝苋对咪唑乙烟酸的抗药性水平，探索反枝苋的抗药性分子机制，为农田杂草抗药性的监测和治理提供依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
供试草种：采自四川、黑龙江的2个反枝苋（A.retroflexus）种群（见表1）。
供试药剂：50 g/L咪唑乙烟酸水剂（巴斯夫欧洲公司）。
1.2 抗药性水平测定
1.2.1 琼脂法
种子催芽： 反枝苋种子在200 mg/L的赤霉素溶液中浸泡12 h，打破休眠。浸泡后的种子洗净晾干。在直径为90 mm的培养皿中垫双层滤纸，加入10 mL蒸馏水。播入待测反枝苋种子，加盖后放入RXZ280 c型人工气候箱中培养，选取整齐露白的种子待测。催芽条件为光照14 h，黑暗10 h，温度30 ℃，湿度33%。
根据预试验结果，参照曹坳程[10]的方法，依次取10 mL不同浓度的咪唑乙烟酸药液与20 mL温度约65 ℃的琼脂水溶液（质量分数为0.8%）混匀，使混合液中有效成分咪唑乙烟酸的终浓度分别达到7、14、28、56、112、224 mg/L，使用移液枪吸取10 mL混合液转入3个培养皿（直径60 mm）中。以蒸馏水为对照。待琼脂冷却后，各种群选择整齐露白的反枝苋种子20粒，均匀播入皿内。加盖，使用封口膜封闭。在光照14 h，黑暗10 h，光照强度为10 000 lx，温度（27±1）℃，湿度（30±7）%的RXZ280 c型的人工气候箱中培养5 d后，测量各皿中20株反枝苋的根长、芽长并记录。
1.2.2 数据统计
计算2种群的芽长抑制率，公式如下：
芽长抑制率（%）=（对照芽长-处理芽长）/对照芽长×100。
使用DPS v 7.05软件，将芽长抑制率转化为几率值，求得毒力回归方程、生长抑制中浓度（GI50）、相关系数r。并根据以下公式计算出抗药性指数（RI）：
抗药性指数（RI）=抗药性种群GI50/敏感性种群GI50。
1.3 分子检测
1.3.1 试材培养
取成都、嫩江2种群种子催芽（步骤同琼脂法）后播种。取上口直径10 cm，高10 cm的塑料盆，填入砂壤土与草炭体积比为2∶1的土壤，每盆均匀播种约30粒种子，覆土1 cm，置于温室内培养。试验期间温室温度白天（30±5）℃，夜间为（20±5）℃，相对湿度（60±5）%。在2～3叶期间苗，每盆定株10株。待叶片长至4～6叶期，各种群取至少10株单株的幼嫩叶片（0.3 g/株），经消毒处理后，单株包装，放入-80 ℃冰箱内保存，备用。
1.3.2 引物设计与合成 根据NCBI的GenBank于2005年提交的反枝苋ALS序列（登录号AF363369.1）设计4对引物（表2），分别包括已经报道并确认能够产生抗性的8个突变位点。其中，IF/IR扩增包括Ala122在内的192 bp的片段；ⅡF/ⅡR扩增包括Pro197、Ala205两个位点在内的385 bp的片段；ⅢF/ⅢR扩增片段为210 bp，包含Asp376、Arg377两位点；IVF/IVR扩增片段为410 bp，包含Trp574、Ser653、Gly654三个位点。引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。用温度梯度PCR仪（Biometra TGradient Thermoblock）确定每对引物的最佳退火温度。
1.3.3 ALS基因片段的克隆
两种群单株植物叶片分别在液氮中研磨成细粉，使用Tiangen公司的DNAquick Plant System快捷型植物基因组DNA提取系统提取基因组DNA，两种群各获得10株植物的DNA样品。PCR的25 μL反应体系包括：8.5 μL的ddH2O，12.5 μL的2×Pfu PCR MasterMix（Tiangen公司），2 μL的反枝苋基因组DNA，上下游引物各1 μL（10 μmol/L）。PCR条件设定为：94 ℃预变性10 min；94 ℃变性30 s，X ℃退火30 s（X为4对引物的退火温度），72 ℃延伸30 s，共33个循环；最后72 ℃延伸10 min。
扩增产物于1%的琼脂糖凝胶中电泳检测。对目的条带进行切胶回收，纯化后连接到pMD18T载体，然后转到大肠杆菌感受态细胞中，涂布于含有ampicillin和Xgal/IPTG的LB固体培养基上，37 ℃培养过夜。挑取15个白色单菌落到含ampicillin的LB培养液中，以200 r/min的速度在37 ℃ 振荡培养5 h，然后以菌液为模板进行转化鉴定。25 μL的PCR体系包括：9.5 μL ddH2O，12.5 μL的2×Pfu PCR MasterMix（Tiangen公司），1 μL的菌液，上下游引物各1 μL（10 μmol/L）。电泳检测后，挑选至少5个阳性克隆送北京三博远志生物技术有限责任公司进行测序验证，引物为通用引物M13，单向测序。
1.3.4 生物信息学分析
用DNAMAN v6软件对试验反枝苋种群ALS基因片段的测序结果进行比对，寻找8个突变位点的差异性。
2 结果与分析
2.1 琼脂法测定反枝苋对咪唑乙烟酸的抗药性水平差异
图1为琼脂法中，按照有效成分咪唑乙烟酸浓度递增顺序排列的反枝苋幼苗形态。由图可见，随着药剂浓度的增加，成都种群（a）在7 mg/L时根长即显著受到抑制；嫩江种群（b）在7 mg/L根长几乎没有变化，当药剂浓度增加到56 mg/L时，根长才明显受到抑制。与抗药性种群相比，敏感性种群的根长对除草剂的反应更加敏锐，这与Tal等[11]进行的试验中，硬直黑麦草对禾草酸的种子生测反应结果一致。
2个反枝苋种群对咪唑乙烟酸的抗药性水平回归分析结果见表3。从表3可看出，线性回归相关系数r均大于0.90，说明随着咪唑乙烟酸浓度的增加，反枝苋芽长逐渐缩短的变化规律符合线性回归。成都种群的GI50为11.20 mg/L，嫩江种群的GI50为52.26 mg/L。抗药性指数（RI，resistance index）为4.67。
2.2 反枝苋ALS基因片段的生物学信息分析
经基因组DNA提取、包含8个突变位点的部分ALS片段的PCR扩增、连接转化及鉴定、测序等步骤，获得目的片段的核苷酸序列。将各长度一致片段与拟南芥ALS序列进行比对后发现，与S种群相比，R种群的10株单株均在高度保守区Domain B处发生了基因突变。TGG突变为TTG，导致574位的色氨酸被亮氨酸取代。
3 讨论
本试验通过琼脂法，对采自四川和黑龙江省2个反枝苋种群的抗药性水平进行了快速检测，结果表明，与成都种群（S）相比，嫩江种群（R）的抗药性指数RI为4.67，已经产生了一定程度的抗性。对咪唑乙烟酸靶标酶ALS部分片段进行克隆、测序后发现，抗药性种群——黑龙江嫩江种群的靶标酶ALS的高度保守区域Domain B发生了基因突变，574位TGG突变为TTG，导致色氨酸被亮氨酸取代。突变的发生可能是导致反枝苋对咪唑乙烟酸产生抗药的重要原因之一。
皿内种子测定法是常用的农田杂草抗药性检测方法，皿内介质通常有滤纸和琼脂2种。2007年Yang等采用滤纸法研究日本看麦娘对高效氟吡甲禾灵的抗性[12]，其结果与整株植物测定法趋势一致。Tal等[11]在检测几种禾本科杂草对ACCase抑制剂类除草剂的抗药性水平试验中，使用了滤纸法。黄媛媛等[9]在检测反枝苋对氯嘧磺隆的抗药性水平时采用了琼脂法。尽管相对于整株植物测定法和酶活测定等方法来说，皿内生测的结果不够准确（具体表现在测定的抗性指数值较低），但其具有试验周期短、占用场地小、节省人力等优点，是快速鉴定抗性种群的方法之一。
杂草对ALS抑制剂的抗药性机制主要有靶标位点抗性（TSR，targetsite resistance）和非靶标位点抗性（NTSR，nontargetsite resistance）2种。基于靶标位点的ALS抑制剂抗性是由于ALS的编码基因中单个氨基酸的取代造成的[1315]，这种取代在ALS基因内部许多位点均有发生。在过去20年里，在50个杂草种群中，共发现8个突变位点以及26种氨基酸替代方式。迄今为止，在28种抗性杂草中，Trp574位已发现2种由于突变产生的氨基酸替代方式，分别为亮氨酸和甘氨酸[16]。国外关于反枝苋抗性机制已有报道，McNaughton等发现Trp574被Leu替换导致反枝苋对咪唑乙烟酸和噻吩璜隆产生抗性[17]，这2种药剂与嫩江县长期大量使用的药剂咪唑乙烟酸、氯嘧磺隆分别同属咪唑啉酮类、磺酰脲类除草剂，本研究的结果与之相符。 非靶标位点的除草剂抗性可能由除草剂代谢机制的增强引起。对除草剂的代谢能够最大程度地减少到达靶标位点的除草剂量，P450解毒酶和GSTs可能参与了这种机制[1819]。本次试验没有对除草剂代谢进行研究，因此不能排除其对抗性产生的贡献，这有待后续研究进行证实。
参考文献
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[10]曹坳程. 一种快速、灵敏的除草剂生物测定方法[J].杂草学报，1992，6（2）：1622.
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关键词：反枝苋； 咪唑乙烟酸； 抗药性； 突变
中图分类号： S 481.4
文献标识码： A
反枝苋（Amaranthus retroflexus L.），英文名为redroot pigweed，别名为西风谷、野米谷等，是我国农田、果园常见的一年生苋科阔叶杂草。反枝苋于19世纪40年代入侵我国，因产籽量大、适应性强的特点而广泛分布，在我国暖温带危害面积达36%[13]，在世界多地被列为恶性杂草。咪唑乙烟酸，商品名为普施特，是20世纪80年代美国氰胺公司开发的咪唑啉酮类除草剂优秀品种， 作用靶标为乙酰乳酸合成酶（ALS），目前广泛应用于大豆田化学除草。针对其残留特点，目前已成功开发了抗咪唑啉酮类作物如玉米、油菜、小麦、水稻等，扩大了该类除草剂的应用范围[4]。乙酰乳酸合成酶，又名乙酰羟酸合成酶，是由细胞核编码的叶绿体酶。它是控制植物体内合成支链氨基酸（亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸）公共途径的关键酶，为磺酰脲类、咪唑啉酮类等多种高效低毒除草剂的靶标酶。
世界范围内已对ALS抑制剂抗药性进行了很多报道。目前已发现的144种ALS抑制剂抗药性杂草中，共有8个ALS基因位点突变的发生经证实与抗药性产生直接相关[57]。这些位点在拟南芥ALS氨基酸序列中相应的位置及表达的氨基酸分别为第122 位丙氨酸（Ala122），第197位脯氨酸（Pro197），第205位丙氨酸（Ala205），第376位天冬氨酸（Asp376），第377位精氨酸（Arg377），第574位色氨酸（Trp574），第653位丝氨酸（Ser653）和第654位甘氨酸（Gly654）。高等植物ALS氨基酸序列有5个不连续的高度保守区，分别为Domain C、Domain A、Domain D、Domain B 和 Domain E。其中，A122位于Domain C；P197位于Domain A；A205位于Domain D；W574位于Domain B；S653位于Domain E。
国外最早于1980年分别在加拿大、法国、德国和美国的农田发现了抗莠去津的反枝苋。我国于1990年在黑龙江的多个地块也发现了抗莠去津的反枝苋[8]，另外抗氯嘧磺隆的反枝苋也在辽宁省有发现[9]。但我国反枝苋抗药性及其机理尚未明确。本研究旨在初步明确我国黑龙江大豆田反枝苋对咪唑乙烟酸的抗药性水平，探索反枝苋的抗药性分子机制，为农田杂草抗药性的监测和治理提供依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
供试草种：采自四川、黑龙江的2个反枝苋（A.retroflexus）种群（见表1）。
供试药剂：50 g/L咪唑乙烟酸水剂（巴斯夫欧洲公司）。
1.2 抗药性水平测定
1.2.1 琼脂法
种子催芽： 反枝苋种子在200 mg/L的赤霉素溶液中浸泡12 h，打破休眠。浸泡后的种子洗净晾干。在直径为90 mm的培养皿中垫双层滤纸，加入10 mL蒸馏水。播入待测反枝苋种子，加盖后放入RXZ280 c型人工气候箱中培养，选取整齐露白的种子待测。催芽条件为光照14 h，黑暗10 h，温度30 ℃，湿度33%。
根据预试验结果，参照曹坳程[10]的方法，依次取10 mL不同浓度的咪唑乙烟酸药液与20 mL温度约65 ℃的琼脂水溶液（质量分数为0.8%）混匀，使混合液中有效成分咪唑乙烟酸的终浓度分别达到7、14、28、56、112、224 mg/L，使用移液枪吸取10 mL混合液转入3个培养皿（直径60 mm）中。以蒸馏水为对照。待琼脂冷却后，各种群选择整齐露白的反枝苋种子20粒，均匀播入皿内。加盖，使用封口膜封闭。在光照14 h，黑暗10 h，光照强度为10 000 lx，温度（27±1）℃，湿度（30±7）%的RXZ280 c型的人工气候箱中培养5 d后，测量各皿中20株反枝苋的根长、芽长并记录。
1.2.2 数据统计
计算2种群的芽长抑制率，公式如下：
芽长抑制率（%）=（对照芽长-处理芽长）/对照芽长×100。
使用DPS v 7.05软件，将芽长抑制率转化为几率值，求得毒力回归方程、生长抑制中浓度（GI50）、相关系数r。并根据以下公式计算出抗药性指数（RI）：
抗药性指数（RI）=抗药性种群GI50/敏感性种群GI50。
1.3 分子检测
1.3.1 试材培养
取成都、嫩江2种群种子催芽（步骤同琼脂法）后播种。取上口直径10 cm，高10 cm的塑料盆，填入砂壤土与草炭体积比为2∶1的土壤，每盆均匀播种约30粒种子，覆土1 cm，置于温室内培养。试验期间温室温度白天（30±5）℃，夜间为（20±5）℃，相对湿度（60±5）%。在2～3叶期间苗，每盆定株10株。待叶片长至4～6叶期，各种群取至少10株单株的幼嫩叶片（0.3 g/株），经消毒处理后，单株包装，放入-80 ℃冰箱内保存，备用。
1.3.2 引物设计与合成 根据NCBI的GenBank于2005年提交的反枝苋ALS序列（登录号AF363369.1）设计4对引物（表2），分别包括已经报道并确认能够产生抗性的8个突变位点。其中，IF/IR扩增包括Ala122在内的192 bp的片段；ⅡF/ⅡR扩增包括Pro197、Ala205两个位点在内的385 bp的片段；ⅢF/ⅢR扩增片段为210 bp，包含Asp376、Arg377两位点；IVF/IVR扩增片段为410 bp，包含Trp574、Ser653、Gly654三个位点。引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。用温度梯度PCR仪（Biometra TGradient Thermoblock）确定每对引物的最佳退火温度。
1.3.3 ALS基因片段的克隆
两种群单株植物叶片分别在液氮中研磨成细粉，使用Tiangen公司的DNAquick Plant System快捷型植物基因组DNA提取系统提取基因组DNA，两种群各获得10株植物的DNA样品。PCR的25 μL反应体系包括：8.5 μL的ddH2O，12.5 μL的2×Pfu PCR MasterMix（Tiangen公司），2 μL的反枝苋基因组DNA，上下游引物各1 μL（10 μmol/L）。PCR条件设定为：94 ℃预变性10 min；94 ℃变性30 s，X ℃退火30 s（X为4对引物的退火温度），72 ℃延伸30 s，共33个循环；最后72 ℃延伸10 min。
扩增产物于1%的琼脂糖凝胶中电泳检测。对目的条带进行切胶回收，纯化后连接到pMD18T载体，然后转到大肠杆菌感受态细胞中，涂布于含有ampicillin和Xgal/IPTG的LB固体培养基上，37 ℃培养过夜。挑取15个白色单菌落到含ampicillin的LB培养液中，以200 r/min的速度在37 ℃ 振荡培养5 h，然后以菌液为模板进行转化鉴定。25 μL的PCR体系包括：9.5 μL ddH2O，12.5 μL的2×Pfu PCR MasterMix（Tiangen公司），1 μL的菌液，上下游引物各1 μL（10 μmol/L）。电泳检测后，挑选至少5个阳性克隆送北京三博远志生物技术有限责任公司进行测序验证，引物为通用引物M13，单向测序。
1.3.4 生物信息学分析
用DNAMAN v6软件对试验反枝苋种群ALS基因片段的测序结果进行比对，寻找8个突变位点的差异性。
2 结果与分析
2.1 琼脂法测定反枝苋对咪唑乙烟酸的抗药性水平差异
图1为琼脂法中，按照有效成分咪唑乙烟酸浓度递增顺序排列的反枝苋幼苗形态。由图可见，随着药剂浓度的增加，成都种群（a）在7 mg/L时根长即显著受到抑制；嫩江种群（b）在7 mg/L根长几乎没有变化，当药剂浓度增加到56 mg/L时，根长才明显受到抑制。与抗药性种群相比，敏感性种群的根长对除草剂的反应更加敏锐，这与Tal等[11]进行的试验中，硬直黑麦草对禾草酸的种子生测反应结果一致。
2个反枝苋种群对咪唑乙烟酸的抗药性水平回归分析结果见表3。从表3可看出，线性回归相关系数r均大于0.90，说明随着咪唑乙烟酸浓度的增加，反枝苋芽长逐渐缩短的变化规律符合线性回归。成都种群的GI50为11.20 mg/L，嫩江种群的GI50为52.26 mg/L。抗药性指数（RI，resistance index）为4.67。
2.2 反枝苋ALS基因片段的生物学信息分析
经基因组DNA提取、包含8个突变位点的部分ALS片段的PCR扩增、连接转化及鉴定、测序等步骤，获得目的片段的核苷酸序列。将各长度一致片段与拟南芥ALS序列进行比对后发现，与S种群相比，R种群的10株单株均在高度保守区Domain B处发生了基因突变。TGG突变为TTG，导致574位的色氨酸被亮氨酸取代。
3 讨论
本试验通过琼脂法，对采自四川和黑龙江省2个反枝苋种群的抗药性水平进行了快速检测，结果表明，与成都种群（S）相比，嫩江种群（R）的抗药性指数RI为4.67，已经产生了一定程度的抗性。对咪唑乙烟酸靶标酶ALS部分片段进行克隆、测序后发现，抗药性种群——黑龙江嫩江种群的靶标酶ALS的高度保守区域Domain B发生了基因突变，574位TGG突变为TTG，导致色氨酸被亮氨酸取代。突变的发生可能是导致反枝苋对咪唑乙烟酸产生抗药的重要原因之一。
皿内种子测定法是常用的农田杂草抗药性检测方法，皿内介质通常有滤纸和琼脂2种。2007年Yang等采用滤纸法研究日本看麦娘对高效氟吡甲禾灵的抗性[12]，其结果与整株植物测定法趋势一致。Tal等[11]在检测几种禾本科杂草对ACCase抑制剂类除草剂的抗药性水平试验中，使用了滤纸法。黄媛媛等[9]在检测反枝苋对氯嘧磺隆的抗药性水平时采用了琼脂法。尽管相对于整株植物测定法和酶活测定等方法来说，皿内生测的结果不够准确（具体表现在测定的抗性指数值较低），但其具有试验周期短、占用场地小、节省人力等优点，是快速鉴定抗性种群的方法之一。
杂草对ALS抑制剂的抗药性机制主要有靶标位点抗性（TSR，targetsite resistance）和非靶标位点抗性（NTSR，nontargetsite resistance）2种。基于靶标位点的ALS抑制剂抗性是由于ALS的编码基因中单个氨基酸的取代造成的[1315]，这种取代在ALS基因内部许多位点均有发生。在过去20年里，在50个杂草种群中，共发现8个突变位点以及26种氨基酸替代方式。迄今为止，在28种抗性杂草中，Trp574位已发现2种由于突变产生的氨基酸替代方式，分别为亮氨酸和甘氨酸[16]。国外关于反枝苋抗性机制已有报道，McNaughton等发现Trp574被Leu替换导致反枝苋对咪唑乙烟酸和噻吩璜隆产生抗性[17]，这2种药剂与嫩江县长期大量使用的药剂咪唑乙烟酸、氯嘧磺隆分别同属咪唑啉酮类、磺酰脲类除草剂，本研究的结果与之相符。 非靶标位点的除草剂抗性可能由除草剂代谢机制的增强引起。对除草剂的代谢能够最大程度地减少到达靶标位点的除草剂量，P450解毒酶和GSTs可能参与了这种机制[1819]。本次试验没有对除草剂代谢进行研究，因此不能排除其对抗性产生的贡献，这有待后续研究进行证实。
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