背景:耐甲氧西林金黄色葡萄球菌已经成为全球院内感染的首要致病菌,建立快速简单的基因敲除方法是研究耐甲氧西林金黄色葡萄球菌毒力、耐药性的重要技术。目的:构建适用于金黄色葡萄球菌基因敲除的质粒,用于金葡菌耐药性及毒力的研究。方法:以p UC19为构建的基本骨架,通过overlap PCR的技术手段,把p CL52.1中p LE194Ts温敏复制子及质粒p HY300PLK中四环素抗性基因片段,通过高保证扩增后,连接入p UC19的Eco RⅠ位点,保留p UC19中所有的多克隆位点,构建大肠杆菌-金黄色葡萄球菌穿梭质粒,并对金黄色葡萄球菌N315 dap B基因进行敲除,通过多重PCR对基因敲除菌株进行鉴定。结果与结论:成功构建了大肠杆菌-金黄色葡萄球菌穿梭质粒p YZ1和p YZ8,并用于金葡菌基因的敲除,通过酶切及overlap技术构建了同源重组质粒p YZ-Δdap B,电转入RN4220进行修饰后,再电转入N315,通过温度筛选,获得了dap B基因突变菌株,成功的敲除了dap B基因。提示p YZ1和p YZ8能够成功用于金黄色葡萄球菌耐药菌株基因的敲除,为进一步研究临床金黄色葡萄球菌分离株耐药性及毒力提供了工具。