建立了黄油中雌酮、α/β-雌二醇、雌三醇和孕酮5种类固醇激素的气相色谱/燃烧炉/同位素比质谱（GC/C/IRMS）溯源方法。样品经乙酸乙酯-环己烷（1:1,V/V）提取,经凝胶渗透色谱（GPC）净化和半制备液相色谱（Pre-HPLC）纯化,纯化液经HP-5MS（30 m×0.25 mm,0.25μm）柱分离,GC/C/IRMS溯源分析和气相色谱-质谱（GC/MS）定性和定量分析。黄油中外源性激素δ¹³C值<-30‰,内源性激素δ¹³C值>-27‰,其中黄油中外源性孕酮δ¹³C值=-30.59‰±0.12‰,内源性孕酮δ¹³C值范围在-26.83‰±0.25‰与-23.80‰±0.33‰之间,单因素方差分析（p值=0.009<0.05）显示内源性孕酮和外源性孕酮的δ¹³C值存在显著差异性。经模拟实验显示,实际样品中引入外源性激素的δ¹³C值与外源性激素δ¹³C值具有同源性。方法灵敏度为15～100ng,方法批内精密度为0.11‰～0.17‰,批间精密度为0.16‰,Pre-HPLC的馏分接收是同位素分馏现象发生和影响测定准确性的主要阶段。结果表明,本方法准确性和特异性好,GC/C/IRMS是鉴别激素来源的有效工具。