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摘 要：目的：建立快速检测腐乳中诱惑红色素的高效液相色谱法。方法：样品溶解调至酸性，聚酰胺富集后进行梯度洗脱，用外标法定量检测。结果：诱惑红的方法线性在1.0～50.0 ?g/mL浓度范围内，线性相关系数为0.999 9，样品的加标回收率为92.00%～103.25%，相对标准偏差为0.89%～1.53%，检出限（S/N=3）为10.0 ?g/kg。结论：本方法具有操作简单、分析时间较短、线性范围宽和检出限低的特点。
关键词：高效液相色谱;诱惑红;腐乳
食用天然色素是从动植物组织中提取出来的，一般对人体无害。食用合成色素属于食用人工合成色素。诱惑红等人工合成色素的着色力强，价格低廉，对于商家来说能很好地提高食品的外观性质，因此被广泛使用。但人工合成色素及其代谢物均具有毒性和致癌性，因此使用诱惑红等人工合成色素一定要控制其使用量，避免过量使用对人体造成危害[1-3]。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 试剂
诱惑红标准物质;甲醇（色谱纯）;0.02 mol/L乙酸铵溶液（pH=4）;聚酰胺粉（200目）;20%柠檬酸;去离子水;甲酸-甲醇溶液;乙醇-氨水溶液。
1.1.2 仪器
美国戴安P680高效液相色谱仪;电子天平;PDA-100二极管阵列检测器（检测波长190～900 nm）;变色龙色谱工作站;恒温水浴锅;烧杯。
1.2 实验方法
1.2.1 标准溶液的制备
准确称取0.100 g诱惑红置50 mL的烧杯中，加水溶解，并把溶液于100 mL容量瓶中定容，得含量1 mg/mL标准储备液。从中吸取适量配成1.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、20.0 μg/mL、30.0 μg/mL、40.0 μg/mL和50.0 μg/mL的系列标准溶液。
1.2.2 样品前处理
称取10.0 g腐乳样品，加30 mL水，于恒温水浴锅中温热溶解。用20%柠檬酸溶液调至酸性（pH=4），取0.5～1.0 g
聚酰胺粉（200目）搅拌片刻，置于60 ℃水浴中加热，使色素完全吸附。将溶液中的聚酰胺粉通过漏斗过滤，剩下溶液用酸性热水洗涤去糖。经甲酸-甲醇溶液洗涤至洗液无色，70 ℃的水多次洗涤至洗液中性，乙醇-氨水液分次解吸色素，收集解吸液于水浴锅中蒸发浓缩后定容至2 mL，转入25 mL比色管中，去离子水定容至刻度，经0.45 μm滤膜过滤后上机待测[4-5]。
1.2.3 定量测定
用标准物质的保留时间定性，采用外标法定量。以质量浓度（μg/mL）为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标绘制标准曲线。根据试样峰面积，从标准曲线上查出试样中组分的实际浓度。
1.2.4 色谱条件
色谱柱：Hypersil ODSC18（5 μm，4.6 mm×200 mm），不锈钢柱;流动相：甲醇、0.02 mol/L乙酸铵溶液（pH=4）;梯度洗脱：甲醇10%～15%，3 min;15%～98%，9 min;98%，6 min;流速：1 mL/min;检测波长：510 nm;柱温：40 ℃;进样量：10 μL。
2 结果与分析
2.1 检测波长的选择
色谱条件下，在190～900 nm波长处扫描，得诱惑红的紫外吸收波谱见图1。图1表明诱惑红在可见光范围内在506 nm波長下有最大吸收。
2.2 样品前处理条件的选择
（1）提取液的选择。本实验提取诱惑红的方法分别试用了去离子水、氨水溶液与乙醇氨水溶液。实验表明各提取液属乙醇氨水溶液提取诱惑红色素的效果最好。
（2）提取液浓缩温度的选择。氨水的沸点是78 ℃，在这个温度下氨水容易挥发，因此提取液的温度选择在80 ℃。
（3）提取液浓缩体积的选择。样品中的目标组分经提取后，提取液浓缩体积定在2 mL左右后定容所溶解的色素较完全而且回收率较好，因此选择2 mL。
2.3 线性关系和检出限
根据选择好的色谱条件下，诱惑红标准物质（5～50 μg/mL）
线性范围内以1.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、20.0 μg/mL、30.0 μg/mL、40.0 μg/mL和50.0 μg/mL的系列标准溶液进样分析，以诱惑红峰面积Y（mAU·min）为纵坐标、进样浓度X（μg/mL）为横坐标作图，计算出线性回归方程为：Y=506.8X+0.099 7，r=0.999 9，表明诱惑红浓度与峰面积具有良好的线性关系。以S/N=3计得到方法的最低检测限为10 μg/kg。
2.4 样品的加标回收
配制不同浓度诱惑红标准溶液（2.0 ?g/mL、4.0 ?g/mL和6.0 ?g/mL）;腐乳样品溶浓度分别为5.24 ?g/mL和10.20 ?g/mL。加标回收以1.2.4方法处理进样，据此计算回收率。由表1可知，不同浓度的样品添加不同浓度的诱惑红标准溶液，诱惑红的回收率为92.00%～103.25%，其相对标准偏差为0.89%～1.53%，本方法是准确可靠的。
2.5 精密度
样品重复测定6次，测得诱惑红峰面积的RSD为1.06%，表明本方法的精密度良好。
2.6 抗干扰实验
胭脂红与诱惑红的理化性质相同，因此选择胭脂红为代表进行抗干扰实验。对腐乳样品处理后，利用同样的色谱条件，分别对胭脂红和诱惑红进行分离检测。结果表明对各自的检出无影响，见图2。
3 结论
本文运用高效液相色谱技术对腐乳中诱惑红进行了快速测定。优化样品前处理条件，有效提取样品诱惑红。依据诱惑红的特性选择了乙醇氨水溶液作为提取液，效率高且可以直接上机，快速方便。对诱惑红标准溶液进行了全扫描光谱分析，并确定检测最适合波长为506 nm。本文方法的检出限10.0 mg/kg，回收率在92.00%～103.25%，RSD值均<5%。本方法测定诱惑红，其线性、精密度和回收率等指标良好，可作为检测食品中诱惑红的推广方法。
参考文献
[1]Asfaram A，Ghaedi M，Abidi H，et al.Synthesis of Fe3O4 CuS Ni2P-CNTs magnetic nanocomposite for sonochemical-assisted sorption and pre-concentration of trace Allura Red from aqueous samples prior to HPLC-UV detection：CCD-RSM design[J].Ultrasonics Sonochemistry，2018，44：240-250.
[2]Chai W B，Wang H J，Zhang Y.Preparation of polydopamine-coated magnetic nanoparticles for dispersive solid-phase extraction of water-soluble synthetic colorants in beverage samples with HPLC analysis[J]Talanta，2016，149：13-20.
[3]吕梦莎，林能镖，梁玉英，等.高效液相色谱法同时测定葡萄酒中16种添加剂[J].食品科学，2016，37（8）：222-225.
[4]Yalcin S，Karakas O.HPLC Detection and Antioxidant Capacity Determination of Brown， Red and Green Algal Pigments in Seaweed Extracts [J]Journal of Chromatographic Science.2021，59（4）：324-337.
[5]Akhtar M.Humayoun，B M.Extraction and quantification of major carotenoids in processed foods and supplements by liquid chromatography[J]Food Chemistry，2008，111（1）：255-261.
关键词：高效液相色谱;诱惑红;腐乳
食用天然色素是从动植物组织中提取出来的，一般对人体无害。食用合成色素属于食用人工合成色素。诱惑红等人工合成色素的着色力强，价格低廉，对于商家来说能很好地提高食品的外观性质，因此被广泛使用。但人工合成色素及其代谢物均具有毒性和致癌性，因此使用诱惑红等人工合成色素一定要控制其使用量，避免过量使用对人体造成危害[1-3]。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 试剂
诱惑红标准物质;甲醇（色谱纯）;0.02 mol/L乙酸铵溶液（pH=4）;聚酰胺粉（200目）;20%柠檬酸;去离子水;甲酸-甲醇溶液;乙醇-氨水溶液。
1.1.2 仪器
美国戴安P680高效液相色谱仪;电子天平;PDA-100二极管阵列检测器（检测波长190～900 nm）;变色龙色谱工作站;恒温水浴锅;烧杯。
1.2 实验方法
1.2.1 标准溶液的制备
准确称取0.100 g诱惑红置50 mL的烧杯中，加水溶解，并把溶液于100 mL容量瓶中定容，得含量1 mg/mL标准储备液。从中吸取适量配成1.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、20.0 μg/mL、30.0 μg/mL、40.0 μg/mL和50.0 μg/mL的系列标准溶液。
1.2.2 样品前处理
称取10.0 g腐乳样品，加30 mL水，于恒温水浴锅中温热溶解。用20%柠檬酸溶液调至酸性（pH=4），取0.5～1.0 g
聚酰胺粉（200目）搅拌片刻，置于60 ℃水浴中加热，使色素完全吸附。将溶液中的聚酰胺粉通过漏斗过滤，剩下溶液用酸性热水洗涤去糖。经甲酸-甲醇溶液洗涤至洗液无色，70 ℃的水多次洗涤至洗液中性，乙醇-氨水液分次解吸色素，收集解吸液于水浴锅中蒸发浓缩后定容至2 mL，转入25 mL比色管中，去离子水定容至刻度，经0.45 μm滤膜过滤后上机待测[4-5]。
1.2.3 定量测定
用标准物质的保留时间定性，采用外标法定量。以质量浓度（μg/mL）为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标绘制标准曲线。根据试样峰面积，从标准曲线上查出试样中组分的实际浓度。
1.2.4 色谱条件
色谱柱：Hypersil ODSC18（5 μm，4.6 mm×200 mm），不锈钢柱;流动相：甲醇、0.02 mol/L乙酸铵溶液（pH=4）;梯度洗脱：甲醇10%～15%，3 min;15%～98%，9 min;98%，6 min;流速：1 mL/min;检测波长：510 nm;柱温：40 ℃;进样量：10 μL。
2 结果与分析
2.1 检测波长的选择
色谱条件下，在190～900 nm波长处扫描，得诱惑红的紫外吸收波谱见图1。图1表明诱惑红在可见光范围内在506 nm波長下有最大吸收。
2.2 样品前处理条件的选择
（1）提取液的选择。本实验提取诱惑红的方法分别试用了去离子水、氨水溶液与乙醇氨水溶液。实验表明各提取液属乙醇氨水溶液提取诱惑红色素的效果最好。
（2）提取液浓缩温度的选择。氨水的沸点是78 ℃，在这个温度下氨水容易挥发，因此提取液的温度选择在80 ℃。
（3）提取液浓缩体积的选择。样品中的目标组分经提取后，提取液浓缩体积定在2 mL左右后定容所溶解的色素较完全而且回收率较好，因此选择2 mL。
2.3 线性关系和检出限
根据选择好的色谱条件下，诱惑红标准物质（5～50 μg/mL）
线性范围内以1.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、20.0 μg/mL、30.0 μg/mL、40.0 μg/mL和50.0 μg/mL的系列标准溶液进样分析，以诱惑红峰面积Y（mAU·min）为纵坐标、进样浓度X（μg/mL）为横坐标作图，计算出线性回归方程为：Y=506.8X+0.099 7，r=0.999 9，表明诱惑红浓度与峰面积具有良好的线性关系。以S/N=3计得到方法的最低检测限为10 μg/kg。
2.4 样品的加标回收
配制不同浓度诱惑红标准溶液（2.0 ?g/mL、4.0 ?g/mL和6.0 ?g/mL）;腐乳样品溶浓度分别为5.24 ?g/mL和10.20 ?g/mL。加标回收以1.2.4方法处理进样，据此计算回收率。由表1可知，不同浓度的样品添加不同浓度的诱惑红标准溶液，诱惑红的回收率为92.00%～103.25%，其相对标准偏差为0.89%～1.53%，本方法是准确可靠的。
2.5 精密度
样品重复测定6次，测得诱惑红峰面积的RSD为1.06%，表明本方法的精密度良好。
2.6 抗干扰实验
胭脂红与诱惑红的理化性质相同，因此选择胭脂红为代表进行抗干扰实验。对腐乳样品处理后，利用同样的色谱条件，分别对胭脂红和诱惑红进行分离检测。结果表明对各自的检出无影响，见图2。
3 结论
本文运用高效液相色谱技术对腐乳中诱惑红进行了快速测定。优化样品前处理条件，有效提取样品诱惑红。依据诱惑红的特性选择了乙醇氨水溶液作为提取液，效率高且可以直接上机，快速方便。对诱惑红标准溶液进行了全扫描光谱分析，并确定检测最适合波长为506 nm。本文方法的检出限10.0 mg/kg，回收率在92.00%～103.25%，RSD值均<5%。本方法测定诱惑红，其线性、精密度和回收率等指标良好，可作为检测食品中诱惑红的推广方法。
参考文献
[1]Asfaram A，Ghaedi M，Abidi H，et al.Synthesis of Fe3O4 CuS Ni2P-CNTs magnetic nanocomposite for sonochemical-assisted sorption and pre-concentration of trace Allura Red from aqueous samples prior to HPLC-UV detection：CCD-RSM design[J].Ultrasonics Sonochemistry，2018，44：240-250.
[2]Chai W B，Wang H J，Zhang Y.Preparation of polydopamine-coated magnetic nanoparticles for dispersive solid-phase extraction of water-soluble synthetic colorants in beverage samples with HPLC analysis[J]Talanta，2016，149：13-20.
[3]吕梦莎，林能镖，梁玉英，等.高效液相色谱法同时测定葡萄酒中16种添加剂[J].食品科学，2016，37（8）：222-225.
[4]Yalcin S，Karakas O.HPLC Detection and Antioxidant Capacity Determination of Brown， Red and Green Algal Pigments in Seaweed Extracts [J]Journal of Chromatographic Science.2021，59（4）：324-337.
[5]Akhtar M.Humayoun，B M.Extraction and quantification of major carotenoids in processed foods and supplements by liquid chromatography[J]Food Chemistry，2008，111（1）：255-261.