【摘 要】
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为研究水牛瘦素(Leptin)的功能,构建leptin基因真核表达载体EGFP-leptin,检测leptin在NIH/3T3细胞中的表达并分析其生物学特性.根据水牛leptin基因序列设计引物,并在上下游引物分别添加Hind Ⅲ和BamH Ⅰ酶切位点,以pMD18-T-leptin载体为模板,PCR扩增leptin基因,并亚克隆至载体pEGFP-Nl,以双酶切和DNA测序鉴定EGFP-leptin重组质粒;然后采用脂质体2000将重组质粒转染到NIH/3T3细胞,经G418筛选,获得稳定转染的细胞株,R
【机 构】
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广西大学动物科技学院,广西南宁530004
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为研究水牛瘦素(Leptin)的功能,构建leptin基因真核表达载体EGFP-leptin,检测leptin在NIH/3T3细胞中的表达并分析其生物学特性.根据水牛leptin基因序列设计引物,并在上下游引物分别添加Hind Ⅲ和BamH Ⅰ酶切位点,以pMD18-T-leptin载体为模板,PCR扩增leptin基因,并亚克隆至载体pEGFP-Nl,以双酶切和DNA测序鉴定EGFP-leptin重组质粒;然后采用脂质体2000将重组质粒转染到NIH/3T3细胞,经G418筛选,获得稳定转染的细胞株,RT-PCR及Western blot检测EGFP-Leptin融合蛋白表达.动物试验分3组,处理组从小鼠尾静脉注入重组质粒1 μg/只,对照组和禁食组注射等体积生理盐水,3 d后称其体质量,采用ELISA法测定小鼠血清中Leptin水平.结果显示,成功构建真核表达载体EGFP-leptin,转染NIH/3T3细胞后出现绿色荧光;RT-PCR和Western blot进一步证实了 Leptin表达.动物试验显示,处理组和禁食组小鼠体质量下降速率高于对照组,差异显著(P＜0.05),处理组血清Leptin水平高于对照组,差异显著(P＜0.05).以上结果表明,EGFP-leptin能够在NIH/3T3细胞中稳定表达,产生的融合蛋白具有良好的生物学活性.
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