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摘要：应用高效液相色谱-电喷雾串联质谱技术，建立了养殖用水中氯霉素残留量的定量分析方法。在水样中加入内标，经乙酸乙酯提取，以5 mmol/L乙酸铵和甲醇为流动相，经C18色谱柱分离，采用串联质谱多重反应监测（MRM）进行定性定量分析，内标法定量。氯霉素在0.5～20 μg/L浓度范围内具有良好线性，相关系数为0.9994，检出限和定量限分别为0.002 μg/L和0.005 μg/L。在0.02、0.05、0.20 μg/L三个浓度水平范围的平均回收率为88.0%～93.1%，相对标准偏差为5.3%～8.4%。本方法的灵敏度较高，且简单、快速，可以满足养殖用水中氯霉素残留检测的需要。
关键词：氯霉素 高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS） 养殖用水 内标法
中图分类号：S948 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2015）06-0000-00
氯霉素（chloramphenicol，CAP）是一种有效的广谱抗菌素，曾广泛的应用于畜牧、水产养殖。但是氯霉素能抑制人体骨髓造血功能，引起人类的再生障碍性贫血，白血病、过敏性变态反应等严重疾病，低浓度的药物残留还会诱发致病菌的耐药性[1-3]。因此，氯霉素在许多国家被禁止在食品性动物中使用。我国在农业行业标准《无公害食品 渔用药物使用准则》（NY5071-2002）和《无公害食品 畜禽饲养兽药使用准则》（NY 5030-2006）[4-5]中也已将氯霉素列为禁用药物。但是由于氯霉素具有价廉、高效、用量少的特点，氯霉素仍然存在非法使用和误用的可能。因此有必要建立养殖生产过程中氯霉素的有效检测方法，严控违禁药物的使用，确保养殖生产过程的无害化。
目前氯霉素的检测方法主要集中在动物源性食品的检测[6-8]，因为水体和养殖产品的样品性质、制备以及取样量存在较大差异，所需检测方法也有所不同。本研究建立了养殖用水中氯霉素的高效液相色谱-电喷雾串联质谱检测方法，该方法具有快速高效、灵敏度高的优点，可应用于养殖用水中的氯霉素残留监测。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
高效液相色谱（美国Agilent公司，1200系列），三重四极杆质谱仪（美国Agilent公司，6410系列），漩涡振荡器（德国IKA公司，MS2系列），旋转蒸发仪（德国IKA公司，RV 10 Basic V系列），纯水机（美国Millipore公司，Milli-Q系列）。甲醇（HPLC级）、乙腈（HPLC级），购于Honeywell公司；氯化钠、乙酸铵均为AR级，购于广州化学试剂厂。标准品氯霉素（CAP）、氘代氯霉素（CAP-d5），购自美国Sigma-Aldrich公司。
1.2 标准工作曲线配制
准确称取0.0500 g氯霉素标准品，用甲醇溶解并定容至50 mL，配成1 g/L的标准贮备液。于-20 ℃下保存。实验时，根据需要配成适当浓度的标准工作液，于4 ℃下保存，当天使用。准确称取0.0500 g氘代氯霉素标准品，用甲醇溶解并定容至50 mL，配成1 g/L的标准贮备液。于-20 ℃下保存。用甲醇稀释至10 mg/L，作为标准内标工作液使用。
1.3 仪器工作参数
（1）色谱条件；Agilent Eclipse C18液相色谱柱（4.6× 50mm，3.5 μm）。流动相：5 mmol/L 乙酸铵：甲醇（4+6）。流速：0.5 mL/min。进样量：10 μL。（2）质谱条件；电喷雾负电离源（ESI-）；离子雾化源温度350℃；气流速10L/min；雾化器压力40 psi；喷雾电压4000V；扫描模式：多重反应监测（Multiple Reaction Monitor，MRM）。优化后的检测条件见表1。
1.4 测定步骤
（1）样品保存与处理；水样经砂芯漏斗过滤除去固体悬浮物，于冰箱4℃下贮存备用。（2）提取；量取100.0mL水样，置于250 mL分液漏斗中，加入50μL标准内标工作液。加入5g氯化钠，振摇；再加入30mL乙酸乙酯，振摇1 min，静置分层，取上层乙酸乙酯于100 mL梨形瓶中。再加入20 mL乙酸乙酯重复提取一次，合并乙酸乙酯提取液，于旋转蒸发仪50℃水浴下减压浓缩至近干，加入1.0 mL5%甲醇水溶液，涡旋30s，过0.2μm滤膜后，供液相色谱-串联质谱测定。
2 结果与讨论
2.1 质谱条件的优化
根据氯霉素的分子结构和理化性质，选择ESI为离子源。因为氯霉素具有较强的电负性，适合使用ESI负离子模式监测。使用流动注射进样方式对氯霉素及其同位素内标物CAP-d5的母离子进行扫描，得到其准分子离子峰为321.1和326.2，以适当的碰撞能量对准分子离子峰扫描，选择响应最强的子离子作为定量离子，选择响应相对较强的子离子作为定性离子。选择MRM扫描模式对母离子与子离子进行裂解电压和碰撞能量的优化，优化后的参数见表1。
2.2 色谱条件的优化
比较了乙腈和甲醇作为有机相，结果发现使用甲醇比使用乙腈的基线稳定。因为氯霉素在负离子模式下检测，因此LC-MS/MS常用的甲酸并不适合添加，而实验中加入适量的乙酸铵可以促进电离和改善峰形。最终实验选择甲醇和5 mmol/L乙酸铵混合溶液作为流动相。氯霉素与氯霉素-d5在多重反应监测下的特征离子图质量色谱图见图1。
图1 5.0 μg/L氯霉素与氯霉素-d5在多重反应监测下的特征离子图质量色谱图
2.3 方法的线性关系与检出限
养殖水中溶解的有机质可能导致LC-MS/MS信号的增强或者减弱，从而影响结果的准确性和可靠性。因此，选择在水样中添加氯霉素的同位素化合物CAP-d5作为内标物，有效的避免了不同水体中的基质效应，提高检测结果的准确性。配制0.5 、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/L的氯霉素标准溶液，并加入氯霉素-d5内标工作液，使每毫升标准工作溶液中含有混合氘代同位素内标5.0 ng。按上述条件进行HPLC-MS/MS分析，得到氯霉素的线性方程为y=1135.96x+307.47，相关系数R2为09994。氯霉素在0.5～20.0 μg/L浓度范围具有良好线性关系，见图2所示。在空白水样中添加氯霉素标准溶液，以3倍和10倍信噪比（S/N）对应的加标浓度算得方法检出限（LOD）和定量限（LOQ）分别为0.002 μg/L和0.005 μg/L。
图2 氯霉素标准曲线
2.4 回收率与精密度
在不含氯霉素的水样中，分别添加0.02、0.05和0.20 μg/L浓度水平的氯霉素标准溶液，按上述实验方法，每一添加水平平行测定5次，测得0.02～0.20 μg/L添加水平范围的加标回收率结果见表2。
3 结语
本研究建立了养殖用水中氯霉素的LC-MS/MS同位素内标法检测方法，该方法具有快速简单、检出限低、重现性好等特点，适合于养殖用水中氯霉素残留量的快速准确分析。
参考文献
[1] 张龙 主编.兽医药物化学[M].北京：中国农业出版社，1999，280-282.
[2] 庄无忌 主编.各国食品和饲料中农药兽药残留大全[M].北京：中国对外经济贸易出版社，1998，982-1014.
[3] Aerts， Keukens. Liquid chromatographic determination of chloramphenicol residues in meat ： interlaboratory study[J].J Assoc off Anal Chem， 1989，72（4）：570-576.
[4] NY5071-2002.无公害食品-渔用药物使用准则[S].
[5] NY5030-2006.无公害食品-畜禽饲养兽药使用准则[S].
[6] GB/T 22338-2008.动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定[S].
[7] 白艳玲，陈剑刚，张彩虹 等.水产品中氯霉素残留量测定方法的研究[J].中国卫生检验杂志，2005（6）：672-674.
[8] 毛丽莎，刘红河，刘桂华 等.动物源性食品中氯霉素残留量的检测方法研究[J].现代预防医学，2010（6）：1123-1125.
收稿日期：2015-03-09
基金项目：广东省科技厅省级科技计划项目（2013B040400002）
作者简介：许均图（1989—），男，广东茂名，本科，毕业于中山大学，研究方向：农产品中兽药残留检测方法研究。E-mail：582625732@qq.com
关键词：氯霉素 高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS） 养殖用水 内标法
中图分类号：S948 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2015）06-0000-00
氯霉素（chloramphenicol，CAP）是一种有效的广谱抗菌素，曾广泛的应用于畜牧、水产养殖。但是氯霉素能抑制人体骨髓造血功能，引起人类的再生障碍性贫血，白血病、过敏性变态反应等严重疾病，低浓度的药物残留还会诱发致病菌的耐药性[1-3]。因此，氯霉素在许多国家被禁止在食品性动物中使用。我国在农业行业标准《无公害食品 渔用药物使用准则》（NY5071-2002）和《无公害食品 畜禽饲养兽药使用准则》（NY 5030-2006）[4-5]中也已将氯霉素列为禁用药物。但是由于氯霉素具有价廉、高效、用量少的特点，氯霉素仍然存在非法使用和误用的可能。因此有必要建立养殖生产过程中氯霉素的有效检测方法，严控违禁药物的使用，确保养殖生产过程的无害化。
目前氯霉素的检测方法主要集中在动物源性食品的检测[6-8]，因为水体和养殖产品的样品性质、制备以及取样量存在较大差异，所需检测方法也有所不同。本研究建立了养殖用水中氯霉素的高效液相色谱-电喷雾串联质谱检测方法，该方法具有快速高效、灵敏度高的优点，可应用于养殖用水中的氯霉素残留监测。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
高效液相色谱（美国Agilent公司，1200系列），三重四极杆质谱仪（美国Agilent公司，6410系列），漩涡振荡器（德国IKA公司，MS2系列），旋转蒸发仪（德国IKA公司，RV 10 Basic V系列），纯水机（美国Millipore公司，Milli-Q系列）。甲醇（HPLC级）、乙腈（HPLC级），购于Honeywell公司；氯化钠、乙酸铵均为AR级，购于广州化学试剂厂。标准品氯霉素（CAP）、氘代氯霉素（CAP-d5），购自美国Sigma-Aldrich公司。
1.2 标准工作曲线配制
准确称取0.0500 g氯霉素标准品，用甲醇溶解并定容至50 mL，配成1 g/L的标准贮备液。于-20 ℃下保存。实验时，根据需要配成适当浓度的标准工作液，于4 ℃下保存，当天使用。准确称取0.0500 g氘代氯霉素标准品，用甲醇溶解并定容至50 mL，配成1 g/L的标准贮备液。于-20 ℃下保存。用甲醇稀释至10 mg/L，作为标准内标工作液使用。
1.3 仪器工作参数
（1）色谱条件；Agilent Eclipse C18液相色谱柱（4.6× 50mm，3.5 μm）。流动相：5 mmol/L 乙酸铵：甲醇（4+6）。流速：0.5 mL/min。进样量：10 μL。（2）质谱条件；电喷雾负电离源（ESI-）；离子雾化源温度350℃；气流速10L/min；雾化器压力40 psi；喷雾电压4000V；扫描模式：多重反应监测（Multiple Reaction Monitor，MRM）。优化后的检测条件见表1。
1.4 测定步骤
（1）样品保存与处理；水样经砂芯漏斗过滤除去固体悬浮物，于冰箱4℃下贮存备用。（2）提取；量取100.0mL水样，置于250 mL分液漏斗中，加入50μL标准内标工作液。加入5g氯化钠，振摇；再加入30mL乙酸乙酯，振摇1 min，静置分层，取上层乙酸乙酯于100 mL梨形瓶中。再加入20 mL乙酸乙酯重复提取一次，合并乙酸乙酯提取液，于旋转蒸发仪50℃水浴下减压浓缩至近干，加入1.0 mL5%甲醇水溶液，涡旋30s，过0.2μm滤膜后，供液相色谱-串联质谱测定。
2 结果与讨论
2.1 质谱条件的优化
根据氯霉素的分子结构和理化性质，选择ESI为离子源。因为氯霉素具有较强的电负性，适合使用ESI负离子模式监测。使用流动注射进样方式对氯霉素及其同位素内标物CAP-d5的母离子进行扫描，得到其准分子离子峰为321.1和326.2，以适当的碰撞能量对准分子离子峰扫描，选择响应最强的子离子作为定量离子，选择响应相对较强的子离子作为定性离子。选择MRM扫描模式对母离子与子离子进行裂解电压和碰撞能量的优化，优化后的参数见表1。
2.2 色谱条件的优化
比较了乙腈和甲醇作为有机相，结果发现使用甲醇比使用乙腈的基线稳定。因为氯霉素在负离子模式下检测，因此LC-MS/MS常用的甲酸并不适合添加，而实验中加入适量的乙酸铵可以促进电离和改善峰形。最终实验选择甲醇和5 mmol/L乙酸铵混合溶液作为流动相。氯霉素与氯霉素-d5在多重反应监测下的特征离子图质量色谱图见图1。
图1 5.0 μg/L氯霉素与氯霉素-d5在多重反应监测下的特征离子图质量色谱图
2.3 方法的线性关系与检出限
养殖水中溶解的有机质可能导致LC-MS/MS信号的增强或者减弱，从而影响结果的准确性和可靠性。因此，选择在水样中添加氯霉素的同位素化合物CAP-d5作为内标物，有效的避免了不同水体中的基质效应，提高检测结果的准确性。配制0.5 、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/L的氯霉素标准溶液，并加入氯霉素-d5内标工作液，使每毫升标准工作溶液中含有混合氘代同位素内标5.0 ng。按上述条件进行HPLC-MS/MS分析，得到氯霉素的线性方程为y=1135.96x+307.47，相关系数R2为09994。氯霉素在0.5～20.0 μg/L浓度范围具有良好线性关系，见图2所示。在空白水样中添加氯霉素标准溶液，以3倍和10倍信噪比（S/N）对应的加标浓度算得方法检出限（LOD）和定量限（LOQ）分别为0.002 μg/L和0.005 μg/L。
图2 氯霉素标准曲线
2.4 回收率与精密度
在不含氯霉素的水样中，分别添加0.02、0.05和0.20 μg/L浓度水平的氯霉素标准溶液，按上述实验方法，每一添加水平平行测定5次，测得0.02～0.20 μg/L添加水平范围的加标回收率结果见表2。
3 结语
本研究建立了养殖用水中氯霉素的LC-MS/MS同位素内标法检测方法，该方法具有快速简单、检出限低、重现性好等特点，适合于养殖用水中氯霉素残留量的快速准确分析。
参考文献
[1] 张龙 主编.兽医药物化学[M].北京：中国农业出版社，1999，280-282.
[2] 庄无忌 主编.各国食品和饲料中农药兽药残留大全[M].北京：中国对外经济贸易出版社，1998，982-1014.
[3] Aerts， Keukens. Liquid chromatographic determination of chloramphenicol residues in meat ： interlaboratory study[J].J Assoc off Anal Chem， 1989，72（4）：570-576.
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[5] NY5030-2006.无公害食品-畜禽饲养兽药使用准则[S].
[6] GB/T 22338-2008.动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定[S].
[7] 白艳玲，陈剑刚，张彩虹 等.水产品中氯霉素残留量测定方法的研究[J].中国卫生检验杂志，2005（6）：672-674.
[8] 毛丽莎，刘红河，刘桂华 等.动物源性食品中氯霉素残留量的检测方法研究[J].现代预防医学，2010（6）：1123-1125.
收稿日期：2015-03-09
基金项目：广东省科技厅省级科技计划项目（2013B040400002）
作者简介：许均图（1989—），男，广东茂名，本科，毕业于中山大学，研究方向：农产品中兽药残留检测方法研究。E-mail：582625732@qq.com