论文部分内容阅读
摘要： 通過微波辅助提取技术结合响应面法优化山苍子核仁油提取条件，以期建立更高产率的提取方法。该研究在单因素设计基础上，选取液料比、微波功率、萃取时间、萃取温度4个主要因素，分析这4个因素对山苍子核仁油提取率的影响。结果表明：通过建立多元回归拟合分析，得出山苍子核仁油提取最佳工艺条件为液料比1∶16，萃取温度为69 ℃，微波功率为337 W，萃取时间为63 min，在此条件下山苍子核仁油提取率为37.42%，与环己烷溶剂回流法相比较提取率提高了30.11%。气质联用仪分析结果显示，山苍子核仁油主要成分有16种占总成分的88.21%，鉴定出10种脂肪酸占总成分的78.24%，饱和脂肪酸有4种占总成分的43.23%，不饱和脂肪酸有6种占总成分的35.01%，脂肪酸中含量最高的为月桂酸（31.36%）。该研究结果表明该方法严谨、可靠，采用微波辅助提取山苍子核仁油是可行的。
关键词： 山苍子核仁油， 微波辅助， 响应面法， 提取率， 气质联用仪， 化学成分
中图分类号： Q946文献标识码： A文章编号： 10003142（2017）08107409
广西植物37卷8期朱辉等： 响应面法优化微波辅助提取山苍子核仁油的研究收稿日期： 20170213修回日期： 20170324
基金项目： 四川省科技厅项目（2016JY0203， 2014FZ0120）；四川省教育厅项目（17ZB0380）；校级特色培育项目（2015TP008Y） [Supported by the Program of Sichuan Science and Technology Department（2016JY0203， 2014FZ0120）； Program of Sichuan Education Department（17ZB0380）；Characteristic Cultivation Program of University （2015TP008Y）]。
作者简介： 朱辉（1989-），男，安徽阜阳人，硕士，助教，研究方向为天然产物提取分离，成分活性分析，（Email）zh326552917@163.com。
*通信作者 Optimization of microwaveassisted extraction of Litsea
cubeba kernel oil by response surface methodology
ZHU Hui*， SUN JiaYing， PENG LinCai， LAI Chuan， ZHU ChaoJu
（ School of Chemistry and Chemical Engineering， Sichuan University of Arts and Science， Dazhou 635000， Sichuan， China ）
Abstract： Based on the single factor experiment， several independent variables were analyzed for the optimization of extraction conditions of Litsea cubeba kernel oil with response surface analysis methodology under microwaveassisted， in order to establish a higher yield extraction method on the best possible extract rate of L. cubeba kernel oil， inciuding liquid to solid ratio， microwave power， extraction time and extraction temperature. The quadratic regression model equation was established to describe the extraction process. The results showed that optimum conditions of L. cubeba kernel oil extraction were that liquid to solid ratio was 1∶16， extraction temperature was 69 ℃， microwave power was 337 W， and extraction time was 63 min. The extraction rate of L. cubeba kernel oil under the condition was up to 37.42%， and 30.11% improvement in the extraction rate was obtained than the cyclohexane solvent refluxing method. The results of GCMS analysis showed that the main components of L. cubeba kernel oil had sixteen components for 88.21% of the total composition， ten kinds of fatty acids were identified， accounting for about 78.24% of the total. Four kinds of saturated fatty acids made up 43.23% of the total， the other six kinds of unsaturated fatty acids accounted for 35.01%. The highest content of fatty acids was lauric acid 31.36%. It indicates that using microwaveassisted extraction of oil from litsea cubeba kernel is feasible. Key words： Litsea cubeba kernel oil， microwaveassisted， response surface method， extraction rate， GCMS， chemical components
山苍子（ Litsea cubeba）是一种重要的香料植物，又名山鸡椒、山胡椒或木姜子，属樟科木姜子属，落叶灌木或小乔木。广泛分布于我国南方的四川、云南、贵州、广西等省（区）。从山苍子果皮中提取的浅黄色山苍子油，具有柠檬香气，主要成分为柠檬醛，是合成多种高档香料的主要原料，在医药、食品、化工方面也具有广泛的应用（陈学恒，2003）。提取山苍子油过程中，会产生大量的固体残渣，主要为山苍子核仁。山苍子核仁富含丰富的混合脂肪酸，其中脂肪酸的主要成分为月桂酸和癸酸（查宝萍等，2013），月桂酸是润滑油添加剂、食品添加剂、化工和医药等方面的重要原料（Chen et al，2010；赵婷等，2010）。山苍子核仁油在一定程度上可替代椰子油，具有很高的经济价值（Nik Norulaini et al，2009）。
我国山苍子资源丰富，相当部分山苍子油产区的固体残渣被直接焚烧丢弃，不仅造成了资源的极大浪费，还可能处置不当而对环境造成影响。虽有少数企业采用压榨法提取山苍子核仁油，但由于设备和工艺技术落后，导致产油率低，企业效益差（周军等，2016）。采用超臨界CO2萃取技术（陈铁壁等，2009），出油率高，但工艺设备要求高，成本大，不能实际应用于规模化工业生产。环己烷、石油醚、汽油等溶剂回流法为常见提取技术，但由于操作的局限性，提取率有待进一步提高。不同地域的山苍子含油量和采摘时间也不同，这些因素对山苍子核仁油的深度开发和利用均受到一定限制。针对以上种种问题，目前急需找到一种提取率高且对工艺设备要求和投入低，可以应用到实际工业大规模生产的一种提取方法。本研究利用微波辅助提取法的优势（付红军，2016），在环己烷溶剂回流提取法的基础之上，研究山苍子核仁油的提取工艺条件，提高出油率和脂肪酸纯度。再利用响应面法（RSM）在最短时间内全面考察和优化山苍子核仁油提取工艺条件（梁志远等，2016；任雪峰等，2014），并结合GCMS技术进行成分分析，以期更加科学的手段建立山苍子核仁油最优提取工艺条件，对我国山苍子核仁油产业化综合开发利用和增加山苍子核仁油产品附加值有重要意义和经济价值。
1材料与方法
1.1 材料及仪器
1.1.1 材料山苍子果实于八月初采摘于四川达州凤凰山，由成都中医药大学马云桐教授鉴定。
1.1.2 主要仪器Agilent GC/MS 6890N/5975C 联用仪（美国Agilent公司）； DS3510DTH型超声波提取仪（上海生析超声仪器有限公司，频率：40 kHZ）；NJL073型微波炉（南京杰全微波设备有限公司）。
1.1.3 试剂环己烷（分析纯）为提取溶剂 （赵欧等，2011；袁先友等，2006）。
1.2 方法
1.2.1 提取工艺加入两倍质量的蒸馏水于除去叶柄后的山苍子鲜果中，在功率40 kHZ条件下超声30 min后，剥皮取核，将得到的山苍子核仁置30 ℃鼓风干燥箱干燥30 min，然后用植物粉碎机粉碎过80目筛，取过筛后的核仁20.00 g于微波炉中，加入不同体积的环己烷在不同条件下提取，提取结束后过滤，滤液经旋转蒸发回收溶剂后得到山苍子核仁油。将核仁油在60 ℃下真空干燥至恒重，准确称量计算提取率。
山苍子核仁油提取率（%）= 山苍子核仁油质量（g）/山苍子核仁质量（g）×100%
1.2.2 单因素试验设计按照1.2.1 提取工艺进行单因素分析，分别考察液料比、粒度大小、微波功率、萃取时间、萃取温度5个因素对山苍子核仁油提取率的影响。
1.2.3 响应面优化试验设计采用响应面法，对微波辅助提取山苍子核仁油工艺条件进行四因素三水平为中心的试验分析。利用DesignExpert 8.0.6软件综合评价单因素最佳组合，最终确定最优山苍子核仁油提取工艺条件（付勇等，2010）。
1.2.4 山苍子核仁油GCMS分析条件色谱柱：HP5弹性石英毛细管柱（30.0 m × 0.25 mm × 0.25 μm）；载气：He， 流速2.0 mL·Min1，恒流模式；进样口温度280 ℃；分流进样，分流比 10∶1；柱温：初始温度60 ℃，保持10 min，以4 ℃·min1升至280 ℃，保持10 min；传输线温度280 ℃；EI离子源；电子能量70 eV；电子倍增器电压980 V；容积延迟10 min；离子源温度250 ℃；扫描方式：全扫描；质量扫描范围：50-550； 扫描速率：每秒钟五次全扫描。
2结果与分析
2.1 单因素试验设计
影响山苍子核仁油提取率高低的因素众多，本研究着重从液料比、微波功率、萃取时间、萃取温度、粒度大小5个关键性影响因素入手，先进行单因素试验分析，确定最佳单因素水平，然后再进行响应面法综合分析。
2.1.1 液料比对山苍子核仁油提取率的影响在萃取温度70 ℃、粒度60目、萃取时间60 min、微波功率350 W条件下按不同液料比提取山苍子核仁油并计算产率，结果如图1所示。当液料比低于15时，随液料比的增加，提取率逐渐增加，其中液料比在10～15之间时提取率增幅较为明显，当液料比高于15时，提取率呈现下降趋势。在液料比小的情况下，山苍子核仁与环己烷不能充分接触，导致出油率较低；当液料比增加到一定程度时提取率下降。因此选取液料比为1∶10、1∶15、1∶20三个水平因子进行响应面分析。
2.1.2 萃取温度对山苍子核仁油提取率的影响在液料比1∶15、粒度60目、萃取时间60 min、微波功率350 W条件下按不同萃取温度提取山苍子核仁油，计算提取率，结果如图2所示。当温度低于70 ℃时，提取率随温度的升高而增加；温度高于70 ℃，提取率反而降低。随着温度的升高，可能与部分核仁油被破坏有一定关系。因此选取萃取温度为60 ℃、70 ℃、80 ℃三个水平因子进行响应面分析。 2.1.3 粒度大小对山苍子核仁油提取率的影响在液料比1∶15、萃取温度70 ℃、萃取时间60 min、微波功率350 W条件下按不同粒度大小提取山苍子核仁油，计算产率，结果如图3所示。随粒度目数增加，山苍子核仁表面积增大，其接触环己烷的面积增加，提取率升高。如果山苍子核仁过细，在提取过程中易发生顶冲，不利于仪器的操作控制。一旦发生顶冲，必须重新提取，加大了工作量。合适的粒度大小是提取山苍子核仁油效率高低的必要条件。因此，选取粒度为80目作为山苍子核仁油提取条件。
2.1.4萃取时间对山苍子核仁油提取率的影响在液料比1∶15、萃取温度70 ℃、粒度60目、微波功率350 W条件下按不同萃取时间提取山苍子核仁油，计算产率，结果如图4所示。随萃取时间增加，提取率呈现出先升高后稳定的趋势。萃取时间增加而提取率不变的原因，初步推断在微波提取过程中，山苍子核仁油与环己烷达到动态平衡，间接导致提取率稳定不变。因此选取萃取时间为30、60、90 min三个水平因子进行响应面分析。
2.1.5 微波功率对山苍子核仁油提取率的影响在液料比1∶15、萃取温度70 ℃、粒度60目、萃取时间60 min条件下按不同微波功率提取山苍子核仁油并计算产率，结果如图5所示。随微波功率增大，提取率逐渐增大。当微波功率超过350 W时，提取率呈现下降趋势，可能由于微波功率过大破坏部分油脂所致。因此选取微波功率为300、350、400 W三個水平因子进行响应面分析。
2.2 响应面优化山苍子核仁油提取工艺
2.2.1 试验因素和水平表设计根据单因素试验设计和结果，在单因素试验基础之上，对山苍子核仁油提取率有明显影响的液料比、萃取温度、微波功率、萃取时间4个因素，采用四因素三水平的响应面法进行综合分析，确定提取山苍子核仁油最优组合工艺条件，试验水平和因素设计见表1。
2.2.2 响应面优化结果分析根据DesignExpert 8.0.6软件进行中心组合试验设计和分析，山苍子核仁油提取工艺实验方案和结果见表2。分为24个析因试验和5个中心试验，析因试验是自变量为A、B、C、D所组成的三维定点模型的析因点；中心试验是零点区域所在的中心点，进行5次重复性实验，估计试验误差。
所得数据进行多元回归拟合分析，以山苍子核仁油提取率为响应值，得到自变量与提取率的二次多项回归模型：
Y = 35.47 + 0.69A - 2.77B + 2.57C - 0.23D + 1.86AB + 0.71AC + 0.28AD - 0.027BC + 0.45BD - CD - 1.92A2 - 1.2B2 - 0.57C2 - 0.28D2
式中，Y为山苍子核仁油提取率（%）； A为液料比（mL·g1）；B为萃取温度（℃）；C为微波功率（W）；D为萃取时间（min）。
从表3可以看出，在方差分析和显著性实验结果中，模型F值为3.83，P值为0.0086（P<0.01），此结果说明该模型具有高度的显著性。R2为0.7928，说明该模型因变量变化有79.28%来自于所对应的自变量。模型中Adeq Precisior为8.116，大于4，可知模型的回归方程可信度高，误差小。F值、P值、R2、Adeq Precision数值结果，证明了此模型的可靠性，能够较好地分析和预测山苍子的核仁油提取率。因素B和C对山苍子核仁油提取率有极显著影响，A2和失拟项对山苍子核仁油提取率有显著影响。根据F值大小可知，对山苍子核仁油提取率影响优先条件为B、C、A、D（萃取温度、微波功率、液料比、萃取时间）。
对公式进行一阶偏导数分析，带入公式得出最佳工艺条件为液料比1∶15.75，萃取温度68.5 ℃，微波功率336.88 W，萃取时间63.0 min，此条件下山苍子核仁油提取率预测值为39.06%。
2.2.3 最佳条件验证为了验证此方法的准确性，并根据现实操作条件，将最佳提取条件更改为液料比1∶16，萃取温度69 ℃，微波功率337 W，萃取时间63 min，此条件下山苍子核仁油提取率为37.42%，为预测值的95.80%。为进一步验证本提取技术和产地含量之间的关系，在同等条件下做了环己烷溶剂回流法提取山苍子核仁油，产率为28.76%。可知微波辅助提取技术比环己烷溶剂回流法提取率提高了30.11%，增幅较为显著。可见此模型能够较好地反映出微波辅助提取山苍子核仁油的条件。
2.2.4 因素相互交叉作用分析把四因素中任意两
2.3山苍子核仁油主要化学成分分析
利用GCMS进行分离鉴定，采用峰面积归一化法计算出山苍子核仁油各成分的相对百分含量。其总离子流图谱如图7所示，要求正反匹配度均大于800且相对百分含量大于0.5%，得到相似度大的山苍子核仁油成分主要有16种，各组分名称、保留时间和相对含量列于表4。由表4可知，得到山苍子核仁油主要成分有16种占总成分的88.21%，鉴定出10种脂肪酸，占总成分的78.24%。脂肪酸中含量最高的为月桂酸（31.36%）和油酸（17.23%），两种成分占总成分的49.59%。其中饱和脂肪酸为癸酸（5.47%）、十五烷酸（3.33%）、月桂酸（31.36%）、棕榈酸（3.07%），占总成分的43.23%。不饱和脂肪酸为十四碳烯酸（3.81%）、月桂烯酸（7.18%）、9，12十八碳二烯酸（3.43%）、9十八碳二烯酸（0.89%）、油酸（17.23%）、亚油酸（2.47%），占总成分的35.01%。
李湘洲等（2016）研究表明，共鉴定出8种脂肪酸，含量最高的依次为月桂酸（49.53%）、油酸（13.84%）和癸酸（13.69%）。8种脂肪酸与本研究相同的有6中，其余两种成分癸烯酸（0.58%）和肉豆蔻酸（2.48%）本研究未检测到。本研究含量最高的依次为月桂酸（31.36%）、油酸（17.23%）、月桂烯酸（7.18%）和癸酸（5.47%），主要成分含量和李湘洲等（2016）研究结果基本一致。与何业华（1986）检测出11种成分，其主要成分与本研究含量基本一致，但有5种少量成分（共占总含量4.9%）本研究未检测到。这些成分的差异性可能与产地有一定关系，不同产地的原料，其主要成分未有明显的差异，但含量低的成分有所不同，不同产地成分的差异及质量标准的建立，有待进一步研究。 本研究主要是利用微波辅助提取技术提取山苍子核仁油，结果可知，提取率达到37.42%。利用响应面优化法对几个因素综合分析，得出在影响提取率的因素水平中，萃取温度对提取率的影响极为显著，是决定了提取率高低的重要影响因素，在因素相互交叉作用分析中也进一步得到证实。GCMS成分分析表明，饱和脂肪酸占总成分的43.23%，不饱和脂肪酸占总成分的35.01%，脂肪酸中含量最高的为月桂酸（31.36%）。另外，在设备投入和工艺复杂程度上，微波辅助提取技术比超临界CO2萃取技术要求低，比环己烷、石油醚、汽油等溶剂回流提取山苍子核仁油技术要求稍高，但可实施工业化大规模生产。在保证山苍子核仁油提取率高的基础上，同时降低设备投入成本，说明采用微波辅助提取技术提取山苍子核仁油是可行的。
3结论
微波辅助提取山苍子核仁油技术，在单因素试验和响应面法的基础之上，根据回归模型方差分析和最佳条件验证，再考虑到现实操作条件，确定了微波辅助提取技术提取山苍子核仁油的最优条件为液料比1∶16，萃取温度69 ℃，微波功率337 W，萃取时间63 min，此条件下山苍子核仁油提取率为37.42%，低于预测值1.64%，比环己烷溶剂回流法得率提高30.11%，增幅较为明显。GCMS成分分析表明：山苍子核仁油主要成分有16种占总成分的88.21%，鉴定出10种脂肪酸，占总成分的78.24%。饱和脂肪酸有4种，占总成分的43.23%，不饱和脂肪酸有6种，占总成分的35.01%，脂肪酸中含量最高的为月桂酸（31.36%）。
微波辅助提取山苍子核仁油技术，提取设备简单、投入低，在一定程度上解决了山苍子核仁被直接焚烧丢弃，产油率低，企业效益差等问题。此提取方法的研究，对现有山苍子核仁油提取方法的改进和促进其产业规模化发展具有一定的理论依据和技术支持。
参考文献：
CHEN TB， YUAN XY， ZHANG M， 2009. Study on extraction technology of Litsea cubeba kernel oil by supercritical carbon dioxide [J]. Biomass Chem Eng， 43（1）：5-8. [陈铁壁， 袁先友， 张敏， 2009. 超临界CO2萃取山苍子核仁油的工艺研究 [J]. 生物质化学工程， 43（1）：5-8.]
CHEN XH， 2003. commented on utilization status and induatrialization prospects of natural resouces from Litsea cubeba in china [J]. Sci Sil Sin， 39（4）：134-139. [陳学恒， 2003. 我国山苍子资源利用现状和产业化前景评述 [J]. 林业科学， 39（4）：134-139.]
CHEN YS， XU XM， XU BC， et al， 2010. Microwaveassisted biosynthesis of glycerol monolaurate in reverse micro emulsion system：key parameters and mechanism [J]. Eur Food Res & Technol， 231（5）： 719-726.
FU HJ， 2016. Effect of microwave on chemical components of litsea cubeba oil and its antimicrobial activity [J]. Food Sci， 37（17）65-69. [付红军， 2016. 微波对山苍子油化学成分的影响及其抑菌活性研究 [J]. 食品科学， 37（17）65-69.]
FU Y， YAN SC， LI XP， 2010. technique optimization for extracting tenebrio molitor lipid by response surface methodology [J]. Sci Sil Sin， 46（8）：125-129. [付勇， 严善春， 李小平， 2010. 响应面法优化黄粉虫幼虫虫油脂提取工艺 [J]. 林业科学， 46（8）：125-129.]
HE YH， 1986. A new technology for extraction of litsea cubeba kernel oil [J]. Econ For Res， 4（2）：69-71. [何业华，1986. 一种提取山苍子核油的新工艺 [J]. 经济林研究，4（2）：69-71.]
LIANG ZY， GAN XH， YANG XS， et al， 2016. Optimization of extracting total flavonoids from by response surface methodology [J]. Guihaia， 36（9）：1119-1125. [梁志远， 甘秀海， 杨小生， 等， 2016. 响应面法优化干花豆总黄酮提取工艺研究 [J]. 广西植物， 36（9）：1119-1125.]
LI XZ， ZHOU J， REN T， et al， 2016. Extraction technology and chemical composition of Litsea cubeba kernel oil [J]. J For Engrg， 1（2）：54-58. [李湘洲， 周军， 任腾，等，2016. 山苍子核仁油的提取及其化学成分分析 [J]. 林业工程学报，1（2）：54-58.] NIK NORULAINI NA， SETIANTO WB， ZAIDUL ISM， et al， 2009. Effects of supercritical carbon dioxide extraction parameters on virgin coconut oil yield and mediumchain triglyceride content [J]. Food Chem， 116（1）：193-197.
REN XF， WANG YS， DING XL， et al， 2014. Optimization of extraction technique of pigment from Black Potato by response surface methodology [J]. Guihaia， 34（6）：859-864. [任雪峰， 王永生， 丁秀丽， 等， 2014. 响应面法优化黑土豆色素提取工艺研究 [J]. 广西植物， 34（6）：859-864.]
YUAN XY， CHEN TB， HUANG HX， 2006. Extraction and utilization of Litsea cubeba kernel oil [J]. J Hunan Univ Sci & Eng， 27（11）：181-182. [袁先友，陈铁壁，黄火秀， 2006. 山苍子核仁油的提取及其应用 [J]. 湖南科技学院学报，27（11）：181-182.]
ZHA BP， ZHENG LH， CHEN ZX， et al， 2013. Production of glycerol monolaurate from coconut oil catalyzed by immobilized lipase [J]. Chin Oils & Fats， 38（11）：64-67. [查寶萍， 郑联合， 王莉， 等， 2013. 固定化脂肪酶催化椰子油制备月桂酸单甘油酯 [J]. 中国油脂， 38（11）：64-67.]
ZHAO O， LIU CL， 2011. GC/MS Analysis of volatile oil in the fruit and kernel of Litsea cubeba from Ziyun County in Guizhou [J]. Hubei Agric Sci， 50（18）：3821-3823. [赵欧， 刘春丽， 2011. 贵州紫云山苍子果实与核仁油的GC/MS分析 [J]. 湖北农业科学，50（18）：3821-3823.]
ZHAO T， CHEN GH， ZHANG DH， 2010. The research status and prospect of Litsea cubeba in China [J]. J Fujian For Sci Technol， 37（2）：158-162. [赵婷， 陈国华， 张鼎华， 2010. 我国山苍子的研究现状及展望 [J]. 福建林业科技， 37（2）：158-162.]
ZHOU J， REN T， LI XZ， et al， 2016. Preparation of high purity lauric acid from Litsea cubeba kernel oil [J]. Chin Oils & Fats， 6：64-67. [周军， 任腾， 李湘洲， 等， 2016. 基于山苍子核仁油的高纯度月桂酸的制备 [J]. 中国油脂， 6：64-67.]
关键词： 山苍子核仁油， 微波辅助， 响应面法， 提取率， 气质联用仪， 化学成分
中图分类号： Q946文献标识码： A文章编号： 10003142（2017）08107409
广西植物37卷8期朱辉等： 响应面法优化微波辅助提取山苍子核仁油的研究收稿日期： 20170213修回日期： 20170324
基金项目： 四川省科技厅项目（2016JY0203， 2014FZ0120）；四川省教育厅项目（17ZB0380）；校级特色培育项目（2015TP008Y） [Supported by the Program of Sichuan Science and Technology Department（2016JY0203， 2014FZ0120）； Program of Sichuan Education Department（17ZB0380）；Characteristic Cultivation Program of University （2015TP008Y）]。
作者简介： 朱辉（1989-），男，安徽阜阳人，硕士，助教，研究方向为天然产物提取分离，成分活性分析，（Email）zh326552917@163.com。
*通信作者 Optimization of microwaveassisted extraction of Litsea
cubeba kernel oil by response surface methodology
ZHU Hui*， SUN JiaYing， PENG LinCai， LAI Chuan， ZHU ChaoJu
（ School of Chemistry and Chemical Engineering， Sichuan University of Arts and Science， Dazhou 635000， Sichuan， China ）
Abstract： Based on the single factor experiment， several independent variables were analyzed for the optimization of extraction conditions of Litsea cubeba kernel oil with response surface analysis methodology under microwaveassisted， in order to establish a higher yield extraction method on the best possible extract rate of L. cubeba kernel oil， inciuding liquid to solid ratio， microwave power， extraction time and extraction temperature. The quadratic regression model equation was established to describe the extraction process. The results showed that optimum conditions of L. cubeba kernel oil extraction were that liquid to solid ratio was 1∶16， extraction temperature was 69 ℃， microwave power was 337 W， and extraction time was 63 min. The extraction rate of L. cubeba kernel oil under the condition was up to 37.42%， and 30.11% improvement in the extraction rate was obtained than the cyclohexane solvent refluxing method. The results of GCMS analysis showed that the main components of L. cubeba kernel oil had sixteen components for 88.21% of the total composition， ten kinds of fatty acids were identified， accounting for about 78.24% of the total. Four kinds of saturated fatty acids made up 43.23% of the total， the other six kinds of unsaturated fatty acids accounted for 35.01%. The highest content of fatty acids was lauric acid 31.36%. It indicates that using microwaveassisted extraction of oil from litsea cubeba kernel is feasible. Key words： Litsea cubeba kernel oil， microwaveassisted， response surface method， extraction rate， GCMS， chemical components
山苍子（ Litsea cubeba）是一种重要的香料植物，又名山鸡椒、山胡椒或木姜子，属樟科木姜子属，落叶灌木或小乔木。广泛分布于我国南方的四川、云南、贵州、广西等省（区）。从山苍子果皮中提取的浅黄色山苍子油，具有柠檬香气，主要成分为柠檬醛，是合成多种高档香料的主要原料，在医药、食品、化工方面也具有广泛的应用（陈学恒，2003）。提取山苍子油过程中，会产生大量的固体残渣，主要为山苍子核仁。山苍子核仁富含丰富的混合脂肪酸，其中脂肪酸的主要成分为月桂酸和癸酸（查宝萍等，2013），月桂酸是润滑油添加剂、食品添加剂、化工和医药等方面的重要原料（Chen et al，2010；赵婷等，2010）。山苍子核仁油在一定程度上可替代椰子油，具有很高的经济价值（Nik Norulaini et al，2009）。
我国山苍子资源丰富，相当部分山苍子油产区的固体残渣被直接焚烧丢弃，不仅造成了资源的极大浪费，还可能处置不当而对环境造成影响。虽有少数企业采用压榨法提取山苍子核仁油，但由于设备和工艺技术落后，导致产油率低，企业效益差（周军等，2016）。采用超臨界CO2萃取技术（陈铁壁等，2009），出油率高，但工艺设备要求高，成本大，不能实际应用于规模化工业生产。环己烷、石油醚、汽油等溶剂回流法为常见提取技术，但由于操作的局限性，提取率有待进一步提高。不同地域的山苍子含油量和采摘时间也不同，这些因素对山苍子核仁油的深度开发和利用均受到一定限制。针对以上种种问题，目前急需找到一种提取率高且对工艺设备要求和投入低，可以应用到实际工业大规模生产的一种提取方法。本研究利用微波辅助提取法的优势（付红军，2016），在环己烷溶剂回流提取法的基础之上，研究山苍子核仁油的提取工艺条件，提高出油率和脂肪酸纯度。再利用响应面法（RSM）在最短时间内全面考察和优化山苍子核仁油提取工艺条件（梁志远等，2016；任雪峰等，2014），并结合GCMS技术进行成分分析，以期更加科学的手段建立山苍子核仁油最优提取工艺条件，对我国山苍子核仁油产业化综合开发利用和增加山苍子核仁油产品附加值有重要意义和经济价值。
1材料与方法
1.1 材料及仪器
1.1.1 材料山苍子果实于八月初采摘于四川达州凤凰山，由成都中医药大学马云桐教授鉴定。
1.1.2 主要仪器Agilent GC/MS 6890N/5975C 联用仪（美国Agilent公司）； DS3510DTH型超声波提取仪（上海生析超声仪器有限公司，频率：40 kHZ）；NJL073型微波炉（南京杰全微波设备有限公司）。
1.1.3 试剂环己烷（分析纯）为提取溶剂 （赵欧等，2011；袁先友等，2006）。
1.2 方法
1.2.1 提取工艺加入两倍质量的蒸馏水于除去叶柄后的山苍子鲜果中，在功率40 kHZ条件下超声30 min后，剥皮取核，将得到的山苍子核仁置30 ℃鼓风干燥箱干燥30 min，然后用植物粉碎机粉碎过80目筛，取过筛后的核仁20.00 g于微波炉中，加入不同体积的环己烷在不同条件下提取，提取结束后过滤，滤液经旋转蒸发回收溶剂后得到山苍子核仁油。将核仁油在60 ℃下真空干燥至恒重，准确称量计算提取率。
山苍子核仁油提取率（%）= 山苍子核仁油质量（g）/山苍子核仁质量（g）×100%
1.2.2 单因素试验设计按照1.2.1 提取工艺进行单因素分析，分别考察液料比、粒度大小、微波功率、萃取时间、萃取温度5个因素对山苍子核仁油提取率的影响。
1.2.3 响应面优化试验设计采用响应面法，对微波辅助提取山苍子核仁油工艺条件进行四因素三水平为中心的试验分析。利用DesignExpert 8.0.6软件综合评价单因素最佳组合，最终确定最优山苍子核仁油提取工艺条件（付勇等，2010）。
1.2.4 山苍子核仁油GCMS分析条件色谱柱：HP5弹性石英毛细管柱（30.0 m × 0.25 mm × 0.25 μm）；载气：He， 流速2.0 mL·Min1，恒流模式；进样口温度280 ℃；分流进样，分流比 10∶1；柱温：初始温度60 ℃，保持10 min，以4 ℃·min1升至280 ℃，保持10 min；传输线温度280 ℃；EI离子源；电子能量70 eV；电子倍增器电压980 V；容积延迟10 min；离子源温度250 ℃；扫描方式：全扫描；质量扫描范围：50-550； 扫描速率：每秒钟五次全扫描。
2结果与分析
2.1 单因素试验设计
影响山苍子核仁油提取率高低的因素众多，本研究着重从液料比、微波功率、萃取时间、萃取温度、粒度大小5个关键性影响因素入手，先进行单因素试验分析，确定最佳单因素水平，然后再进行响应面法综合分析。
2.1.1 液料比对山苍子核仁油提取率的影响在萃取温度70 ℃、粒度60目、萃取时间60 min、微波功率350 W条件下按不同液料比提取山苍子核仁油并计算产率，结果如图1所示。当液料比低于15时，随液料比的增加，提取率逐渐增加，其中液料比在10～15之间时提取率增幅较为明显，当液料比高于15时，提取率呈现下降趋势。在液料比小的情况下，山苍子核仁与环己烷不能充分接触，导致出油率较低；当液料比增加到一定程度时提取率下降。因此选取液料比为1∶10、1∶15、1∶20三个水平因子进行响应面分析。
2.1.2 萃取温度对山苍子核仁油提取率的影响在液料比1∶15、粒度60目、萃取时间60 min、微波功率350 W条件下按不同萃取温度提取山苍子核仁油，计算提取率，结果如图2所示。当温度低于70 ℃时，提取率随温度的升高而增加；温度高于70 ℃，提取率反而降低。随着温度的升高，可能与部分核仁油被破坏有一定关系。因此选取萃取温度为60 ℃、70 ℃、80 ℃三个水平因子进行响应面分析。 2.1.3 粒度大小对山苍子核仁油提取率的影响在液料比1∶15、萃取温度70 ℃、萃取时间60 min、微波功率350 W条件下按不同粒度大小提取山苍子核仁油，计算产率，结果如图3所示。随粒度目数增加，山苍子核仁表面积增大，其接触环己烷的面积增加，提取率升高。如果山苍子核仁过细，在提取过程中易发生顶冲，不利于仪器的操作控制。一旦发生顶冲，必须重新提取，加大了工作量。合适的粒度大小是提取山苍子核仁油效率高低的必要条件。因此，选取粒度为80目作为山苍子核仁油提取条件。
2.1.4萃取时间对山苍子核仁油提取率的影响在液料比1∶15、萃取温度70 ℃、粒度60目、微波功率350 W条件下按不同萃取时间提取山苍子核仁油，计算产率，结果如图4所示。随萃取时间增加，提取率呈现出先升高后稳定的趋势。萃取时间增加而提取率不变的原因，初步推断在微波提取过程中，山苍子核仁油与环己烷达到动态平衡，间接导致提取率稳定不变。因此选取萃取时间为30、60、90 min三个水平因子进行响应面分析。
2.1.5 微波功率对山苍子核仁油提取率的影响在液料比1∶15、萃取温度70 ℃、粒度60目、萃取时间60 min条件下按不同微波功率提取山苍子核仁油并计算产率，结果如图5所示。随微波功率增大，提取率逐渐增大。当微波功率超过350 W时，提取率呈现下降趋势，可能由于微波功率过大破坏部分油脂所致。因此选取微波功率为300、350、400 W三個水平因子进行响应面分析。
2.2 响应面优化山苍子核仁油提取工艺
2.2.1 试验因素和水平表设计根据单因素试验设计和结果，在单因素试验基础之上，对山苍子核仁油提取率有明显影响的液料比、萃取温度、微波功率、萃取时间4个因素，采用四因素三水平的响应面法进行综合分析，确定提取山苍子核仁油最优组合工艺条件，试验水平和因素设计见表1。
2.2.2 响应面优化结果分析根据DesignExpert 8.0.6软件进行中心组合试验设计和分析，山苍子核仁油提取工艺实验方案和结果见表2。分为24个析因试验和5个中心试验，析因试验是自变量为A、B、C、D所组成的三维定点模型的析因点；中心试验是零点区域所在的中心点，进行5次重复性实验，估计试验误差。
所得数据进行多元回归拟合分析，以山苍子核仁油提取率为响应值，得到自变量与提取率的二次多项回归模型：
Y = 35.47 + 0.69A - 2.77B + 2.57C - 0.23D + 1.86AB + 0.71AC + 0.28AD - 0.027BC + 0.45BD - CD - 1.92A2 - 1.2B2 - 0.57C2 - 0.28D2
式中，Y为山苍子核仁油提取率（%）； A为液料比（mL·g1）；B为萃取温度（℃）；C为微波功率（W）；D为萃取时间（min）。
从表3可以看出，在方差分析和显著性实验结果中，模型F值为3.83，P值为0.0086（P<0.01），此结果说明该模型具有高度的显著性。R2为0.7928，说明该模型因变量变化有79.28%来自于所对应的自变量。模型中Adeq Precisior为8.116，大于4，可知模型的回归方程可信度高，误差小。F值、P值、R2、Adeq Precision数值结果，证明了此模型的可靠性，能够较好地分析和预测山苍子的核仁油提取率。因素B和C对山苍子核仁油提取率有极显著影响，A2和失拟项对山苍子核仁油提取率有显著影响。根据F值大小可知，对山苍子核仁油提取率影响优先条件为B、C、A、D（萃取温度、微波功率、液料比、萃取时间）。
对公式进行一阶偏导数分析，带入公式得出最佳工艺条件为液料比1∶15.75，萃取温度68.5 ℃，微波功率336.88 W，萃取时间63.0 min，此条件下山苍子核仁油提取率预测值为39.06%。
2.2.3 最佳条件验证为了验证此方法的准确性，并根据现实操作条件，将最佳提取条件更改为液料比1∶16，萃取温度69 ℃，微波功率337 W，萃取时间63 min，此条件下山苍子核仁油提取率为37.42%，为预测值的95.80%。为进一步验证本提取技术和产地含量之间的关系，在同等条件下做了环己烷溶剂回流法提取山苍子核仁油，产率为28.76%。可知微波辅助提取技术比环己烷溶剂回流法提取率提高了30.11%，增幅较为显著。可见此模型能够较好地反映出微波辅助提取山苍子核仁油的条件。
2.2.4 因素相互交叉作用分析把四因素中任意两
2.3山苍子核仁油主要化学成分分析
利用GCMS进行分离鉴定，采用峰面积归一化法计算出山苍子核仁油各成分的相对百分含量。其总离子流图谱如图7所示，要求正反匹配度均大于800且相对百分含量大于0.5%，得到相似度大的山苍子核仁油成分主要有16种，各组分名称、保留时间和相对含量列于表4。由表4可知，得到山苍子核仁油主要成分有16种占总成分的88.21%，鉴定出10种脂肪酸，占总成分的78.24%。脂肪酸中含量最高的为月桂酸（31.36%）和油酸（17.23%），两种成分占总成分的49.59%。其中饱和脂肪酸为癸酸（5.47%）、十五烷酸（3.33%）、月桂酸（31.36%）、棕榈酸（3.07%），占总成分的43.23%。不饱和脂肪酸为十四碳烯酸（3.81%）、月桂烯酸（7.18%）、9，12十八碳二烯酸（3.43%）、9十八碳二烯酸（0.89%）、油酸（17.23%）、亚油酸（2.47%），占总成分的35.01%。
李湘洲等（2016）研究表明，共鉴定出8种脂肪酸，含量最高的依次为月桂酸（49.53%）、油酸（13.84%）和癸酸（13.69%）。8种脂肪酸与本研究相同的有6中，其余两种成分癸烯酸（0.58%）和肉豆蔻酸（2.48%）本研究未检测到。本研究含量最高的依次为月桂酸（31.36%）、油酸（17.23%）、月桂烯酸（7.18%）和癸酸（5.47%），主要成分含量和李湘洲等（2016）研究结果基本一致。与何业华（1986）检测出11种成分，其主要成分与本研究含量基本一致，但有5种少量成分（共占总含量4.9%）本研究未检测到。这些成分的差异性可能与产地有一定关系，不同产地的原料，其主要成分未有明显的差异，但含量低的成分有所不同，不同产地成分的差异及质量标准的建立，有待进一步研究。 本研究主要是利用微波辅助提取技术提取山苍子核仁油，结果可知，提取率达到37.42%。利用响应面优化法对几个因素综合分析，得出在影响提取率的因素水平中，萃取温度对提取率的影响极为显著，是决定了提取率高低的重要影响因素，在因素相互交叉作用分析中也进一步得到证实。GCMS成分分析表明，饱和脂肪酸占总成分的43.23%，不饱和脂肪酸占总成分的35.01%，脂肪酸中含量最高的为月桂酸（31.36%）。另外，在设备投入和工艺复杂程度上，微波辅助提取技术比超临界CO2萃取技术要求低，比环己烷、石油醚、汽油等溶剂回流提取山苍子核仁油技术要求稍高，但可实施工业化大规模生产。在保证山苍子核仁油提取率高的基础上，同时降低设备投入成本，说明采用微波辅助提取技术提取山苍子核仁油是可行的。
3结论
微波辅助提取山苍子核仁油技术，在单因素试验和响应面法的基础之上，根据回归模型方差分析和最佳条件验证，再考虑到现实操作条件，确定了微波辅助提取技术提取山苍子核仁油的最优条件为液料比1∶16，萃取温度69 ℃，微波功率337 W，萃取时间63 min，此条件下山苍子核仁油提取率为37.42%，低于预测值1.64%，比环己烷溶剂回流法得率提高30.11%，增幅较为明显。GCMS成分分析表明：山苍子核仁油主要成分有16种占总成分的88.21%，鉴定出10种脂肪酸，占总成分的78.24%。饱和脂肪酸有4种，占总成分的43.23%，不饱和脂肪酸有6种，占总成分的35.01%，脂肪酸中含量最高的为月桂酸（31.36%）。
微波辅助提取山苍子核仁油技术，提取设备简单、投入低，在一定程度上解决了山苍子核仁被直接焚烧丢弃，产油率低，企业效益差等问题。此提取方法的研究，对现有山苍子核仁油提取方法的改进和促进其产业规模化发展具有一定的理论依据和技术支持。
参考文献：
CHEN TB， YUAN XY， ZHANG M， 2009. Study on extraction technology of Litsea cubeba kernel oil by supercritical carbon dioxide [J]. Biomass Chem Eng， 43（1）：5-8. [陈铁壁， 袁先友， 张敏， 2009. 超临界CO2萃取山苍子核仁油的工艺研究 [J]. 生物质化学工程， 43（1）：5-8.]
CHEN XH， 2003. commented on utilization status and induatrialization prospects of natural resouces from Litsea cubeba in china [J]. Sci Sil Sin， 39（4）：134-139. [陳学恒， 2003. 我国山苍子资源利用现状和产业化前景评述 [J]. 林业科学， 39（4）：134-139.]
CHEN YS， XU XM， XU BC， et al， 2010. Microwaveassisted biosynthesis of glycerol monolaurate in reverse micro emulsion system：key parameters and mechanism [J]. Eur Food Res & Technol， 231（5）： 719-726.
FU HJ， 2016. Effect of microwave on chemical components of litsea cubeba oil and its antimicrobial activity [J]. Food Sci， 37（17）65-69. [付红军， 2016. 微波对山苍子油化学成分的影响及其抑菌活性研究 [J]. 食品科学， 37（17）65-69.]
FU Y， YAN SC， LI XP， 2010. technique optimization for extracting tenebrio molitor lipid by response surface methodology [J]. Sci Sil Sin， 46（8）：125-129. [付勇， 严善春， 李小平， 2010. 响应面法优化黄粉虫幼虫虫油脂提取工艺 [J]. 林业科学， 46（8）：125-129.]
HE YH， 1986. A new technology for extraction of litsea cubeba kernel oil [J]. Econ For Res， 4（2）：69-71. [何业华，1986. 一种提取山苍子核油的新工艺 [J]. 经济林研究，4（2）：69-71.]
LIANG ZY， GAN XH， YANG XS， et al， 2016. Optimization of extracting total flavonoids from by response surface methodology [J]. Guihaia， 36（9）：1119-1125. [梁志远， 甘秀海， 杨小生， 等， 2016. 响应面法优化干花豆总黄酮提取工艺研究 [J]. 广西植物， 36（9）：1119-1125.]
LI XZ， ZHOU J， REN T， et al， 2016. Extraction technology and chemical composition of Litsea cubeba kernel oil [J]. J For Engrg， 1（2）：54-58. [李湘洲， 周军， 任腾，等，2016. 山苍子核仁油的提取及其化学成分分析 [J]. 林业工程学报，1（2）：54-58.] NIK NORULAINI NA， SETIANTO WB， ZAIDUL ISM， et al， 2009. Effects of supercritical carbon dioxide extraction parameters on virgin coconut oil yield and mediumchain triglyceride content [J]. Food Chem， 116（1）：193-197.
REN XF， WANG YS， DING XL， et al， 2014. Optimization of extraction technique of pigment from Black Potato by response surface methodology [J]. Guihaia， 34（6）：859-864. [任雪峰， 王永生， 丁秀丽， 等， 2014. 响应面法优化黑土豆色素提取工艺研究 [J]. 广西植物， 34（6）：859-864.]
YUAN XY， CHEN TB， HUANG HX， 2006. Extraction and utilization of Litsea cubeba kernel oil [J]. J Hunan Univ Sci & Eng， 27（11）：181-182. [袁先友，陈铁壁，黄火秀， 2006. 山苍子核仁油的提取及其应用 [J]. 湖南科技学院学报，27（11）：181-182.]
ZHA BP， ZHENG LH， CHEN ZX， et al， 2013. Production of glycerol monolaurate from coconut oil catalyzed by immobilized lipase [J]. Chin Oils & Fats， 38（11）：64-67. [查寶萍， 郑联合， 王莉， 等， 2013. 固定化脂肪酶催化椰子油制备月桂酸单甘油酯 [J]. 中国油脂， 38（11）：64-67.]
ZHAO O， LIU CL， 2011. GC/MS Analysis of volatile oil in the fruit and kernel of Litsea cubeba from Ziyun County in Guizhou [J]. Hubei Agric Sci， 50（18）：3821-3823. [赵欧， 刘春丽， 2011. 贵州紫云山苍子果实与核仁油的GC/MS分析 [J]. 湖北农业科学，50（18）：3821-3823.]
ZHAO T， CHEN GH， ZHANG DH， 2010. The research status and prospect of Litsea cubeba in China [J]. J Fujian For Sci Technol， 37（2）：158-162. [赵婷， 陈国华， 张鼎华， 2010. 我国山苍子的研究现状及展望 [J]. 福建林业科技， 37（2）：158-162.]
ZHOU J， REN T， LI XZ， et al， 2016. Preparation of high purity lauric acid from Litsea cubeba kernel oil [J]. Chin Oils & Fats， 6：64-67. [周军， 任腾， 李湘洲， 等， 2016. 基于山苍子核仁油的高纯度月桂酸的制备 [J]. 中国油脂， 6：64-67.]