【摘 要】
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目的 构建睫状神经营养因子-绿色荧光蛋白(CNTF-GFP)融合表达质粒,以电穿孔法辅助转染培养的雪旺细胞,为优化细胞移植、促进视神经再生提供效果更好且便于观察的方法.方法 实
【机 构】
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复旦大学附属眼耳鼻喉科医院,上海,复旦大学脑科学研究院,复旦大学上海医学院教育部分子医学重点实验室
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目的 构建睫状神经营养因子-绿色荧光蛋白(CNTF-GFP)融合表达质粒,以电穿孔法辅助转染培养的雪旺细胞,为优化细胞移植、促进视神经再生提供效果更好且便于观察的方法.方法 实验研究.构建重组质粒pcDNA3.1/CNTF-GFP;经测序鉴定后,电穿孔法辅助转染培养的雪旺细胞;荧光显微镜下动态观察转染效果,流式细胞计数;转染24 h后,用RT-PCR及免疫组化法检测基因转染及蛋白表达情况.结果 重组质粒经测序鉴定无误;在3 h即可见部分荧光,12 h逐渐增多,24～72 h到达高峰,持续至7 d仍有表达;流式细胞计数得转染率为44.93%±12.92%,转染24 h后,RT-PCR示目的 基因有较高转录,免疫组化示有CNTF蛋白的高表达,并与GFP蛋白表达部位完全重合.结论 成功构建了CNTF-GFP融合表达质粒;电穿孔法转染雪旺细胞后,表达良好,为制备转基因的种子细胞从而促进视神经再生的研究奠定了基础.
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