【摘 要】
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目的:构建靶向PAR4的人工microRNA表达载体并用于抑制人肠癌细胞SW620中PAR4表达。方法:设计针对人PAR4的人工microRNA序列,利用2次PCR扩增获得目的片段,克隆于pMD-19T载体。
【机 构】
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浙江大学邵逸夫临床医学研究所浙江省生物治疗重点实验室,
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目的:构建靶向PAR4的人工microRNA表达载体并用于抑制人肠癌细胞SW620中PAR4表达。方法:设计针对人PAR4的人工microRNA序列,利用2次PCR扩增获得目的片段,克隆于pMD-19T载体。经DNA测序证实后,将8个串联连接的PAR4人工microRNA序列亚克隆于真核表达载体pcDNA3.1(+),构建成pcDNA3.1(+)-8xPAR4-microR-NA真核表达载体。用脂质体将表达载体转染SW620细胞,经G418筛选出稳定转染细胞系,Western blot检测PAR4的表达水平。结果:DNA测序结果表明,克隆的针对人PAR4的人工microRNA序列正确。Western blot检测结果显示,稳定转染pcDNA3.1(+)-8xPAR4-microRNA载体的SW620中PAR4的表达较对照组明显受到抑制。结论:成功地构建了靶向PAR4的人工microRNA的表达载体,并能明显抑制靶基因的表达,为进一步研究PAR4的功能及探讨以PAR4为靶点的基因治疗打下了基础。
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