【摘 要】
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为建立一种快速、简便检测猫细小病毒(FPV)的聚合酶螺旋反应(PSR)恒温扩增方法,本研究参考GenBank中登录的FPV基因序列(MG924893.1),以其保守基因NS1为靶基因设计并合成分别用于普通PCR和PSR方法的2对特异性引物,以及一对加速引物,经反应条件优化,建立了检测FPV的PSR方法.优化结果显示,体系内包含6 mmol/L MgSO4、0.8 mol/L甜菜碱,67℃恒温反应45min结束反应,然后加入终浓度为20×SYBR GreenI染料,肉眼在可见光下观察颜色变化即可判定检测结果
【机 构】
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甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州730070;青岛易邦生物工程有限公司动物基因工程疫苗国家重点实验室,山东青岛266114
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为建立一种快速、简便检测猫细小病毒(FPV)的聚合酶螺旋反应(PSR)恒温扩增方法,本研究参考GenBank中登录的FPV基因序列(MG924893.1),以其保守基因NS1为靶基因设计并合成分别用于普通PCR和PSR方法的2对特异性引物,以及一对加速引物,经反应条件优化,建立了检测FPV的PSR方法.优化结果显示,体系内包含6 mmol/L MgSO4、0.8 mol/L甜菜碱,67℃恒温反应45min结束反应,然后加入终浓度为20×SYBR GreenI染料,肉眼在可见光下观察颜色变化即可判定检测结果.利用该方法检测猫冠状病毒(FCoV)、猫诺如病毒(FNoV)cDNA和FPV,结果显示除了FPV外,与其他病原均无交叉反应,特异性强;将提取的FPV基因组DNA 10倍倍比稀释,利用建立的PSR方法进行敏感性试验,结果显示,该方法对FPV基因组的最低检测限为6.75×103拷贝/μL,比普通PCR方法检测下限低10倍,敏感性可接受;利用本方法进行组内组间重复试验,结果显示组内与组间重复性试验检测结果一致,均为阳性,重复性好.利用建立的PSR方法对110份疑似感染FPV的猫粪便样品进行检测,结果显示PSR方法与常规PCR方法的检测结果基本一致,二者的总符合率为98.18％,表明本研究建立的PSR方法可用于检测临床样品.本研究首次建立的FPV PSR方法仅需2对引物在67℃下完成,无需复杂的变温仪器,反应后加入染料肉眼即可判定结果,整个过程在45 min内结束,设计引物简单,操作步骤少,用时较短,适合市县级宠物医院FPV感染的快速诊断.
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