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摘要 以东方百合商业品种Viviana的花粉为材料，应用percoll密度梯度离心分离百合花粉，得到了4个分层，第1、2层花粉体积较小，第3、4层花粉较大，但每一层中都观察到了直径在150 μm以上的球形花粉，1、2层数量较少，3、4层数量较多。离心后的花粉分别置于培养基上培养，观察到花粉萌发率较低。
关键词 百合花粉；percoll；密度梯度；离心；分离；花粉萌发
中图分类号 Q944.42 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2015）19-0162-02
百合为百合科百合属植物，其商业品种是世界市场最重要的切花之一，受到广泛欢迎。未减数花粉即花粉的倍性与植株倍性相等，一般是由于植株减数分裂异常产生的，在百合杂交品种中比较常见，这些品种通常染色体同源性较差，减数分裂进行联会时容易失败，产生的未减数花粉有些能够正常萌发，可以用于杂交授粉。百合未减数花粉通常体积明显大于正常花粉，相别于椭圆形的正常花粉，未减数花粉通常是球形的。
percoll分层液对细胞无毒性，流动性差，黏性低，渗透压均匀，适合于细胞分离等试验，应用广泛[1-3]。1983年黄大年利用percoll进行小麦、烟草等植物花粉的分离，取得了很好的效果。本试验学习了前人的经验，将percoll应用于百合花粉的分离，并总结了试验相关情况。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验材料为百合商业品种Viviana，种植于贵州省园艺研究所花卉园区内，Viviana为二倍体O系百合杂交种，其产生的花粉经流式细胞仪检测后确认有二倍体花粉存在。
1.2 试验方法
离心方法完全仿照了黄大年等分离烟草花粉的方法，通过percoll密度梯度离心将Viviana花粉进行分层并分别抽取出来，观察每层花粉的体积及花粉萌发情况[4-6]。
分离样品制备：将大量Viviana花粉置于6 cm培养皿中，加入2 mL 0.25 mol/L的蔗糖溶液搅拌均匀后倾斜静置沉淀10 min，用移液枪尽量抽取底部沉淀花粉后，存放于2 mL离心管待用。
不连续percoll密度工作液制备：按体积比9∶1混合percoll和2.5 mol/L蔗糖溶液，配置成等渗percoll母液（PIS），将此母液按不同比例与0.25 mol/L蔗糖溶液混合成工作液（表1）。
使用注射器在15 mL离心管内铺设不连续梯度，共5层，每层2 mL，由高密度到低密度依次叠加。将1 mL制备好的花粉悬浮液加入最上层，700 r/min离心20 min。将分层的花粉依次抽出，分别放入15 mL离心管内。加入10 mL的0.25 mol/L蔗糖溶液到各个离心管中，700 r/min离心5 min，收集底层花粉。将花粉铺设在培养基上，观察每层花粉的体积，并观察花粉萌发情况[7-8]。培养基配方：100 g/L蔗糖，5 g/L琼脂，20 mg/L硼酸。
2 结果与分析
2.1 离心效果
离心后得到的花粉见图1，从图1可以明显看到花粉分为不连续的4层，将花粉依次抽出后观察体积（图2～5），图中标尺为200 μm。第1层花粉的体积较小，其中很多为干瘪的，饱满花粉大多数长径不到100 μm，圆形花粉较多，体积普遍偏小，观察到1粒直径150 μm以上的球形花粉，整体颜色较浅，边缘透明（图2）。第2层花粉普遍较第1层体积大，椭圆形花粉较多，干瘪花粉较多，能观察到长径接近200 μm的椭圆形大花粉粒，也有150 μm以上的球形花粉，但较为稀少（图3）。第3层花粉依然有大量干瘪花粉，有大量直径在150 μm以上的球形花粉，颜色深黑，透光性差，明显大于百合一般的椭圆形花粉，判断为未减数花粉（图4）。第4层花粉体积更大，观察到直径接近200 μm的巨型花粉1粒，大量花粉是直径在150 μm以上的球形花粉，颜色深黑，透光性差（图5）。综合来看，通过不同密度梯度离心，可以对百合花粉进行较为粗疏的分离，密度的差异将花粉分离开来，但并不足以准确地区分单倍体花粉和未减数花粉，究其原因，虽然2 n花粉内部物质含量高，但是体积也相对更大，并未造成显著的密度增大，但是相对于未经过离心分离的花粉，第3、4层的未减数花粉含量已经大大增加。每层花粉随机取10个视野，统计观察到150 μm以上球型花粉的概率见表2。
2.2 花粉萌发状况观察
离心后的每层花粉分别撒在培养基上，观察萌发状况。正常的Viviana花粉在撒到培养基上之后，大约30 min开始萌发，大多数花粉在2 h后都能长出花粉管。离心后的花粉则要慢得多，24 h后才能看到花粉萌发，并且萌发率偏低，远远不如未经处理的花粉。第2、3层的萌发情况略好，第1层最差，观察到的萌发情况最少，判断此层的花粉大多为败育。第4层情况好于第1层，可以观察到150 μm左右的未减数花粉萌发（图6），但数量很少，大多数不萌发。分析来看，可能是处理中有不利于花粉萌发的因素，或许是离心损伤了花粉内部结构，造成花粉无法萌发，或许是由于百合花粉容易失去活力；液体的浸泡造成了一定损害等，尚需继续研究。每层花粉取10个视野，统计萌发率见表3。
3 结论与讨论
Percoll被大量地应用于细胞分离，黄大年等1983年利用此方法分离了烟草、玉米、黑麦、小麦的花粉，本试验参照该方法应用于百合花粉的分离，总体来看，第3、4层的花粉体积较大，密度也较大，未减数花粉在第1、2层的分布较少，主要集中在下面2层，这样来看，未减数花粉确实在密度上偏大，但是并没有显著的差别，做不到彻底的完全分离，只是比较粗疏的分离。
离心速度方面，较高的转速对于花粉有明显的破坏作用，3 000 r/min可以看到一些破碎的花粉壁。试验中尽量使用低转速，但是过低的转速无法保证花粉分离效果，试验中尝试了500 r/min，离心25 min，分离效果并不好，分析可能是离心时间不够长。 花粉萌发方面，离心处理后的花粉萌发并不好，具体原因还需继续研究，分析很大可能是离心造成的，700 r/min的转速相当于53×g，可能破坏了花粉内部结构，需要进一步研究延长离心时间，减慢离心转速的办法。
离心加入的花粉量方面，在试验中发现，较少的花粉量更容易分层，但是对于实际用于授粉来说，则需要大量的花粉，因此快速分离大量花粉才是试验的目的。在花粉悬浮液的制备过程中，通过适当的低速离心然后抽出部分蔗糖溶液，可以有效浓缩悬浮液，提高一次加样量。
密度梯度离心主要是通过密度的差异来实现分离，在百合花粉分离试验中，总体来看确实提高了未减数花粉在第3、4层中的含量，只要解决萌发率问题，用于有性多倍化育种还是可行的。另外，分层后观察到的未减数花粉以150 μm球型花粉作为标准，但实际上通过流式细胞仪直接检测Viviana花粉的倍性，得到的二倍体峰显示未减数花粉的含量要明显高于显微镜观察的情况，占总数的20%以上，这说明有很大一部分的未减数花粉在外观上并没有达到150 μm球形花粉的标准，体积较大的花粉可能很多是未减数花粉。
4 参考文献
[1] 黄大年，谷明光，颜秋生，等.应用percoll密度梯度离心分离不同类型的花粉粒[J].遗传，1983（2）：10-12.
[2] 鲁云龙.番茄花粉生殖细胞与精细胞的分离纯化[D].哈尔滨：东北林业大学，2014.
[3] 邵邻相.玉米精细胞的分离和形态观察的研究[J].浙江师大学报（自然科学版），1998（1）：48-51.
[4] 朱广廉，陈钟颖，曹宗巽.百合生殖细胞和精细胞的大量制备及其蛋白组成的比较[J].实验生物学报，1995（3）：311-317.
[5] 何方刚，刘良，黄代新，等.不同条件下Percoll密度梯度离心分离组织细胞浮游生物的比较[J].中国法医学杂志，2007（3）：153-156.
[6] 孙富，黄巧玲，黄杏，等.甘蔗叶绿体分离及其蛋白质提取方法研究[J].南方农业学报，2011（5）：463-467.
[7] 刘波洋，吴军，唐琳，等.麻疯树花粉萌发条件分析及percoll分离体系的建立[J].四川大学学报（自然科学版），2013（1）：165-170.
[8] 方李琴.二倍体OT百合2n配子产生及杂交后代鉴定[D].杭州：浙江大学，2013.
关键词 百合花粉；percoll；密度梯度；离心；分离；花粉萌发
中图分类号 Q944.42 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2015）19-0162-02
百合为百合科百合属植物，其商业品种是世界市场最重要的切花之一，受到广泛欢迎。未减数花粉即花粉的倍性与植株倍性相等，一般是由于植株减数分裂异常产生的，在百合杂交品种中比较常见，这些品种通常染色体同源性较差，减数分裂进行联会时容易失败，产生的未减数花粉有些能够正常萌发，可以用于杂交授粉。百合未减数花粉通常体积明显大于正常花粉，相别于椭圆形的正常花粉，未减数花粉通常是球形的。
percoll分层液对细胞无毒性，流动性差，黏性低，渗透压均匀，适合于细胞分离等试验，应用广泛[1-3]。1983年黄大年利用percoll进行小麦、烟草等植物花粉的分离，取得了很好的效果。本试验学习了前人的经验，将percoll应用于百合花粉的分离，并总结了试验相关情况。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验材料为百合商业品种Viviana，种植于贵州省园艺研究所花卉园区内，Viviana为二倍体O系百合杂交种，其产生的花粉经流式细胞仪检测后确认有二倍体花粉存在。
1.2 试验方法
离心方法完全仿照了黄大年等分离烟草花粉的方法，通过percoll密度梯度离心将Viviana花粉进行分层并分别抽取出来，观察每层花粉的体积及花粉萌发情况[4-6]。
分离样品制备：将大量Viviana花粉置于6 cm培养皿中，加入2 mL 0.25 mol/L的蔗糖溶液搅拌均匀后倾斜静置沉淀10 min，用移液枪尽量抽取底部沉淀花粉后，存放于2 mL离心管待用。
不连续percoll密度工作液制备：按体积比9∶1混合percoll和2.5 mol/L蔗糖溶液，配置成等渗percoll母液（PIS），将此母液按不同比例与0.25 mol/L蔗糖溶液混合成工作液（表1）。
使用注射器在15 mL离心管内铺设不连续梯度，共5层，每层2 mL，由高密度到低密度依次叠加。将1 mL制备好的花粉悬浮液加入最上层，700 r/min离心20 min。将分层的花粉依次抽出，分别放入15 mL离心管内。加入10 mL的0.25 mol/L蔗糖溶液到各个离心管中，700 r/min离心5 min，收集底层花粉。将花粉铺设在培养基上，观察每层花粉的体积，并观察花粉萌发情况[7-8]。培养基配方：100 g/L蔗糖，5 g/L琼脂，20 mg/L硼酸。
2 结果与分析
2.1 离心效果
离心后得到的花粉见图1，从图1可以明显看到花粉分为不连续的4层，将花粉依次抽出后观察体积（图2～5），图中标尺为200 μm。第1层花粉的体积较小，其中很多为干瘪的，饱满花粉大多数长径不到100 μm，圆形花粉较多，体积普遍偏小，观察到1粒直径150 μm以上的球形花粉，整体颜色较浅，边缘透明（图2）。第2层花粉普遍较第1层体积大，椭圆形花粉较多，干瘪花粉较多，能观察到长径接近200 μm的椭圆形大花粉粒，也有150 μm以上的球形花粉，但较为稀少（图3）。第3层花粉依然有大量干瘪花粉，有大量直径在150 μm以上的球形花粉，颜色深黑，透光性差，明显大于百合一般的椭圆形花粉，判断为未减数花粉（图4）。第4层花粉体积更大，观察到直径接近200 μm的巨型花粉1粒，大量花粉是直径在150 μm以上的球形花粉，颜色深黑，透光性差（图5）。综合来看，通过不同密度梯度离心，可以对百合花粉进行较为粗疏的分离，密度的差异将花粉分离开来，但并不足以准确地区分单倍体花粉和未减数花粉，究其原因，虽然2 n花粉内部物质含量高，但是体积也相对更大，并未造成显著的密度增大，但是相对于未经过离心分离的花粉，第3、4层的未减数花粉含量已经大大增加。每层花粉随机取10个视野，统计观察到150 μm以上球型花粉的概率见表2。
2.2 花粉萌发状况观察
离心后的每层花粉分别撒在培养基上，观察萌发状况。正常的Viviana花粉在撒到培养基上之后，大约30 min开始萌发，大多数花粉在2 h后都能长出花粉管。离心后的花粉则要慢得多，24 h后才能看到花粉萌发，并且萌发率偏低，远远不如未经处理的花粉。第2、3层的萌发情况略好，第1层最差，观察到的萌发情况最少，判断此层的花粉大多为败育。第4层情况好于第1层，可以观察到150 μm左右的未减数花粉萌发（图6），但数量很少，大多数不萌发。分析来看，可能是处理中有不利于花粉萌发的因素，或许是离心损伤了花粉内部结构，造成花粉无法萌发，或许是由于百合花粉容易失去活力；液体的浸泡造成了一定损害等，尚需继续研究。每层花粉取10个视野，统计萌发率见表3。
3 结论与讨论
Percoll被大量地应用于细胞分离，黄大年等1983年利用此方法分离了烟草、玉米、黑麦、小麦的花粉，本试验参照该方法应用于百合花粉的分离，总体来看，第3、4层的花粉体积较大，密度也较大，未减数花粉在第1、2层的分布较少，主要集中在下面2层，这样来看，未减数花粉确实在密度上偏大，但是并没有显著的差别，做不到彻底的完全分离，只是比较粗疏的分离。
离心速度方面，较高的转速对于花粉有明显的破坏作用，3 000 r/min可以看到一些破碎的花粉壁。试验中尽量使用低转速，但是过低的转速无法保证花粉分离效果，试验中尝试了500 r/min，离心25 min，分离效果并不好，分析可能是离心时间不够长。 花粉萌发方面，离心处理后的花粉萌发并不好，具体原因还需继续研究，分析很大可能是离心造成的，700 r/min的转速相当于53×g，可能破坏了花粉内部结构，需要进一步研究延长离心时间，减慢离心转速的办法。
离心加入的花粉量方面，在试验中发现，较少的花粉量更容易分层，但是对于实际用于授粉来说，则需要大量的花粉，因此快速分离大量花粉才是试验的目的。在花粉悬浮液的制备过程中，通过适当的低速离心然后抽出部分蔗糖溶液，可以有效浓缩悬浮液，提高一次加样量。
密度梯度离心主要是通过密度的差异来实现分离，在百合花粉分离试验中，总体来看确实提高了未减数花粉在第3、4层中的含量，只要解决萌发率问题，用于有性多倍化育种还是可行的。另外，分层后观察到的未减数花粉以150 μm球型花粉作为标准，但实际上通过流式细胞仪直接检测Viviana花粉的倍性，得到的二倍体峰显示未减数花粉的含量要明显高于显微镜观察的情况，占总数的20%以上，这说明有很大一部分的未减数花粉在外观上并没有达到150 μm球形花粉的标准，体积较大的花粉可能很多是未减数花粉。
4 参考文献
[1] 黄大年，谷明光，颜秋生，等.应用percoll密度梯度离心分离不同类型的花粉粒[J].遗传，1983（2）：10-12.
[2] 鲁云龙.番茄花粉生殖细胞与精细胞的分离纯化[D].哈尔滨：东北林业大学，2014.
[3] 邵邻相.玉米精细胞的分离和形态观察的研究[J].浙江师大学报（自然科学版），1998（1）：48-51.
[4] 朱广廉，陈钟颖，曹宗巽.百合生殖细胞和精细胞的大量制备及其蛋白组成的比较[J].实验生物学报，1995（3）：311-317.
[5] 何方刚，刘良，黄代新，等.不同条件下Percoll密度梯度离心分离组织细胞浮游生物的比较[J].中国法医学杂志，2007（3）：153-156.
[6] 孙富，黄巧玲，黄杏，等.甘蔗叶绿体分离及其蛋白质提取方法研究[J].南方农业学报，2011（5）：463-467.
[7] 刘波洋，吴军，唐琳，等.麻疯树花粉萌发条件分析及percoll分离体系的建立[J].四川大学学报（自然科学版），2013（1）：165-170.
[8] 方李琴.二倍体OT百合2n配子产生及杂交后代鉴定[D].杭州：浙江大学，2013.