【摘 要】
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目的 构建编码MAGE-A3的真核表达载体,体外转录获得MAGE-A3mRNA,在哺乳动物细胞NIH/3T3中表达MAGE-A3蛋白.方法 通过逆转录PCR从三阴型乳腺癌细胞系4T1中扩增得到MAGE-A3编码
【机 构】
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贵州医科大学生物与工程学院生物技术教研室,贵阳550025贵州医科大学生物与医学工程重点实验室/贵州省免疫细胞与抗体工程研究中心/医药生物技术工程研究中心,贵阳550025;贵州医科大学生物与工程学院
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目的 构建编码MAGE-A3的真核表达载体,体外转录获得MAGE-A3mRNA,在哺乳动物细胞NIH/3T3中表达MAGE-A3蛋白.方法 通过逆转录PCR从三阴型乳腺癌细胞系4T1中扩增得到MAGE-A3编码基因,插入到载体pcDNA3.1(+)中,成功构建重组表达载体pcDNA3.1-MAGE作为体外转录RNA的模板.利用T7体外转录试剂盒获得MAGE-A3RNA,添加poly(A)尾后进行mRNA纯化.将纯化后的MAGE-A 3 mRNA转染到NIH/3T3细胞中,Westernblot实验检测MAGE-A3蛋白的表达.结果 pcDNA3.1-MAGE-A3正确表达和构建.体外转录MAGE-A3 mRNAA260/A280为1.92,浓度是872.3 ng/μl,长度约为500 bp.转染MAGE-A3 mRNA后,NIH/3T3能表达大小约35 ku的MAGE-A3蛋白.结论 成功构建编码MAGE-A3的真核表达载体,体外转录获得纯度较高的MAGE-A3 mRNA,该mR-NA能在NIH/3T3细胞中表达MAGE-A3蛋白.
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