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（天津生物工程职业技术学院，天津 300462）
摘要 ［目的］克隆生防菌芽孢形成关键基因spo0A启动子Pspo0A，并检测其特性。［方法］从生防菌B579 DNA中，经PCR扩增芽孢形成关键基因spo0A启动子Pspo0A，插入载体pGFP，构建重组表达质粒pGFPPspo0A。［结果］重组表达质粒经双酶切和PCR鉴定，证明构建正确，测序，结果与GenBank中的序列同源性为98%。［结论］该方法获得了含有绿色荧光蛋白基因和芽孢形成关键基因Spo0A的重组质粒，为进一步研究生防菌B579芽孢形成规律奠定了基础。
关键词 生防菌；枯草芽孢杆菌；芽孢
中图分类号 S188文献标识码 A文章编号 0517-6611（2014）19-06152-03
The Research of Spore Form Key Genes of Biocontrol Bacillus subtilis B579
JIA Junhui
(Tianjin Vocational College of Bioengineering, Tianjin 300462)
Abstract ［Objective］ To clone and express the promoter of spore form key genes of Bacillus subtilis and determine the property of expressed product. ［Method］ The promoter of spore form key genes spo0A of B. subtilis was amplified from chromosome DNA of B. subtilis by PCR and inserted into vector pGFP. The constructed recombinant secretory expression vector pGFPPspo0A was transformed to B579 by Electrotransformation. ［Result］ Both restriction analysis and PCR proved that recombinant plasmid pGFPPspo0A was constructed correctly. Sequencing result proved that the homology of nucleotide sequence of target gene was 98% to that reported in GenBank. ［Conclusion］ The study will lay a foundation for further study form law of biocontrol bacterium B579.
Key words Biocontrol bacterium; Bacillus subtilis; Spore
作者简介 贾钧辉（1986- ），男，天津人，硕士研究生，研究方向：微生物制药。
收稿日期 20140528
枯草芽孢杆菌是一种好氧、产芽孢、杆状的革兰氏阳性细菌，对人畜无毒无害，能产生多种抗菌素和酶，具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力。许多性状优良的枯草芽孢杆菌生防菌株已经进行温室或大田防治研究，对黄瓜［1］、辣椒［2］、水稻［3］、小麦［4］等农作物病害显出较好的防治效果。枯草芽孢杆菌在发酵过程中有生成芽孢的特性，芽孢的大量生成会严重影响一些目的产物的生产和高浓度菌体的获得。因此，在发酵中前期应严格控制发酵条件，及时检测菌体生长状态，预防过早生成芽孢，而在发酵后期应促进芽孢的生成，从而有利于高芽孢浓度菌剂的制备［5］。对于芽孢的形成就目前的研究进展来看，主要是AbrB蛋白和spo0家族基因。spo0家族基因包括很多，如，spo0A，spo0B，spo0F等。spo0A是进入芽孢阶段重要的转录调控因子，是DNA复制的抑制剂［6］。孢子形成的起始被一个复杂集合体-蛋白激酶，磷酸化蛋白和磷酸酯酶所控制的。多组分物质的磷酸化允许输入和多重集合，不连续的新陈代谢和环境因子。这个信号转导系统输出的决定性是Spo0A转录因子的磷酸化。
课题组前期研究中筛选到的枯草芽孢杆菌B579，对多种常见的土传病害表现出明显防治效果［7］，具有良好的应用前景。笔者利用基因工程技术对B579芽孢形成的关键基因进行分析，获得了含有绿色荧光蛋白基因和芽孢形成关键基因Spo0A的重组质粒，以期为进一步研究生防菌B579芽孢形成规律奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌种及载体。供试菌种为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）B579，质粒为pUC18和pGFP。
1.1.2 主要试剂。限制性内切酶Xba I和EcoR I、pfu聚合酶、T4DNA连接酶、DNA提取试剂盒、质粒小提试剂盒和DNA marker，均由北京全式金生物技术有限公司提供；胶回收试剂盒，由北京天恩泽基因科技有限公司提供。
1.2 方法
1.2.1 引物设计及合成。根据NCBI报道的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168 spo0A基因序列（Gene ID：938655），分析其启动子Pspo0A，开始设计1对特异性扩增引物，上游引物5’端加有Xba I酶切位点，下游引物5’端加有EcoR I酶切位点：Pspo0A1：5’TGCTCTAGAGTTTCTTCCTCCCCAAATGTAGTTAACAGGA3’，下划线为Xba I酶切位点；Pspo0A2：5’CCGGAATTCACTGCCGGAGTTTCCGGCAGTTTTTTTATTTTGA3’，下划线为EcoR I酶切位点。引物交由大连宝生物工程有限公司合成。
1.2.2 目的基因的扩增。按DNA提取试剂盒说明书提取枯草芽孢杆菌的基因组DNA，以总基因组为模版进行PCR扩增。反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，60 ℃复性20 s，72 ℃延伸15 s，共循环30个循环，72 ℃再延伸10 min。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.2.3
重组表达质粒pGFPPspo0A的构建。将纯化后的PCR产物和载体pGFP78分别经Xba I和EcoR I双酶切，胶回收目的基因片段和载体片段，经T4 DNA连接酶16 ℃连接12 h，构建重组表达质粒pGFPPspo0A，利用电转化法进行转化。
2 结果与分析
2.1 枯草芽孢杆菌B579基因组DNA的提取 枯草芽孢杆菌B579（Bacillus Subtilis B579）基因组DNA质量的好坏直接影响获取spo0A基因启动子（Pspo0A）的质量。因此，取3 ml枯草芽孢杆菌B579（进入对数期）菌液进行基因组DNA的提取，根据电泳图1显示，基因组DNA条带单一，提取完整，并无降解，无杂质，无拖尾，获得了质量较好的基因组DNA。
注：M：Trans15K DNA Marker；1：The genomic DNA。
图1 枯草芽孢杆菌B579基因组DNA
2.2 spo0A序列分析 根据NCBI报道，spo0A基因803 bp。将所测序列与GenBank数据库中的序列进行Blast，与GenBank已公布的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis168 spo0A基因两者相似性分别为97%。因此，说明B579中具有spo0A基因（图2）。
注：M：Trans2KTM Plus DNA Marker；1：spo0A基因 PCR 产物。
图2 spo0A基因PCR产物
2.3 spo0A基因在发酵过程中表达量的分析 取发酵过程中6、8、10 h培养的枯草芽孢杆菌，采用RTPCR法检测spo0A基因在发酵不同时间的表达量。图3、5表明，发酵过程中spo0A基因的表达量是不同的，随发酵过程时间增加，所检测到的CT逐渐增大，表征为spo0A基因的表达量。通过对芽孢形成规律的研究，Spo0A磷酸化是芽孢形成最初始的信号。根据发酵过程活菌及芽孢计数，枯草芽孢杆菌在这个时期进入到芽孢形成的初始阶段，在此阶段进行芽孢形成的干预应具有明显效果。
图4表明，spo0A基因引物的特异性很好。在引物溶解曲线中只出现一个单独的尖峰，说明引物特异性好，根据以上结果可知，在发酵过程6~10 h，spo0A基因表达量与芽孢数量呈正相关。
图3 RTPCR检测枯草芽孢杆菌spo0A基因表达量
图4 spo0A基因引物溶解曲线
图5 CT值随时间变化曲线
2.4 spo0A基因启动子的克隆 根据NCBI报道，spo0A基因启动子（Pspo0A）全长294 bp。以枯草芽孢杆菌B579的基因组DNA为模板，通过PCR，扩增spo0A基因启动子。图6表明，PCR扩增产物亮度明显，在300 bp左右出现特异性条带，其大小与spo0A基因启动子（Pspo0A）294 bp大小基本一致，说明PCR扩增结果正确。
注：M：Trans2KTM Plus DNA Marker；1：spo0A基因启动子 PCR 产物。
图6 spo0A基因启动子PCR产物
2.5 克隆载体的构建 利用pfu聚合酶得到的spo0A基因启动子（Pspo0A）片段为平末端片段，纯化后的片段直接与pGFP78平末端克隆载体连接。挑取单菌落培养，按照质粒小提试剂盒步骤从单克隆菌液中提取质粒，进行PCR扩增及对重组质粒进行双酶切验证。鉴定正确的克隆载体，交由上海生工生物工程技术有限公司测序。
图7为重组克隆质粒PCR验证结果，图7的第1泳道是以重组质粒pGFPPspo0A为模板的PCR反应，得到了一条大小在300 bp左右的条带，大小与图7中PCR产物大小结果相符。图8为重组克隆质粒pGFPPspo0A双酶切验证结果，图中
注：M：Trans Mark I DNA Marker；1：pGFPPspo0A PCR。
图7 重组克隆质粒pGFPPspo0A PCR验证
注：M：Trans2KTM II Plus DNA Marker；1：pGFPPspo0A / EcoR I /Xba I。
图8 重组克隆质粒pGFPPspo0A双酶切验证
显示从pGFPPspo0A上切下一条大小为300 bp左右的片段，大小与PCR结果相符，另一条4 800 bp左右大小的条带与空质粒大小一致，说明克隆载体pGFPPspo0A构建成功。
2.6 spo0A 基因启动子序列分析将所测序列与GenBank数据库中的序列进行Blast，与GenBank已公布的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis168 spo0A基因启动子两者相似性为98%。
3 结论与讨论
试验以枯草芽孢杆菌B579基因组DNA为模板，扩增得到芽孢形成基因启动子Pspo0A，其长度与NCBI上报道的spo0A启动子大小相同，均为294 bp。将Pspo0A连接到pGFP78上，构建pGFPPspo0A重组质粒。通过测序验证质粒构建成功。此重组质粒可以为枯草芽孢杆菌快速检测芽孢形成提供基础。以枯草芽孢杆菌B579 RNA为模版，通过反转录，得到cDNA，RTPCR检测芽孢形成关键基因spo0A的表达量，结果表明在发酵过程前期（6~10 h）中，随发酵过程的进行，spo0A的表达量与芽孢数量呈正相关。该结论为进一步研究提供了重要的理论依据。
参考文献
［1］ 张淑梅，王玉霞，李晶，等．基因标记枯草芽孢杆菌BS68A在黄瓜上定殖［J］．生物技术，2006，16（4）：73-74．
［2］ LEE K J，SERALATHAN K K，HAN S S，et al．Biological control of Phytophthora blight in red pepper（Capsicum annuum L.）using Bacillus subtilis［J］．World Journal of Microbiology and Biotechnology，2008，24：1139-1145．
［3］ 穆常青，潘玮，陆庆光，等．枯草芽孢杆菌对稻瘟病的防治效果评价及机制初探 ［J］．中国生物防治，2006，22（2）：158-160．
［4］ KHAN M R，FISCHER S，EGAN D，et al．Biological control of fusarium seedling blight disease of wheat and barley ［J］．Phytopathology，2006，96：386-394．
［5］ ZHANG Y C，JIA J H，ZHENG Y，et al．Optimization of sporulation of biocontrol bacteria B579 by twostep control strategy ［J］．Agricultural Science and Technology，2011，12（2）：249-252．
［6］ VIRGINIA CASTILLALLORENTE，DANIEL MUOZESPN，LAURENTINO VILLAR，et al．Spo0A．the key transcriptional regulator for entrance into sporulation，is an inhibitor of DNA replication ［J］．The EMBO Journal，2006，25：3890-3899．
［7］ CHEN F，WANG M，ZHENG Y，et al.Quantitative changes of plant defense enzymes and phytohormone in biocontrol of cucumber Fusarium wilt by Bacillus subtilis B579 ［J］.World Journal of Microbiology and Biotechnology，2010，26：675-684.
摘要 ［目的］克隆生防菌芽孢形成关键基因spo0A启动子Pspo0A，并检测其特性。［方法］从生防菌B579 DNA中，经PCR扩增芽孢形成关键基因spo0A启动子Pspo0A，插入载体pGFP，构建重组表达质粒pGFPPspo0A。［结果］重组表达质粒经双酶切和PCR鉴定，证明构建正确，测序，结果与GenBank中的序列同源性为98%。［结论］该方法获得了含有绿色荧光蛋白基因和芽孢形成关键基因Spo0A的重组质粒，为进一步研究生防菌B579芽孢形成规律奠定了基础。
关键词 生防菌；枯草芽孢杆菌；芽孢
中图分类号 S188文献标识码 A文章编号 0517-6611（2014）19-06152-03
The Research of Spore Form Key Genes of Biocontrol Bacillus subtilis B579
JIA Junhui
(Tianjin Vocational College of Bioengineering, Tianjin 300462)
Abstract ［Objective］ To clone and express the promoter of spore form key genes of Bacillus subtilis and determine the property of expressed product. ［Method］ The promoter of spore form key genes spo0A of B. subtilis was amplified from chromosome DNA of B. subtilis by PCR and inserted into vector pGFP. The constructed recombinant secretory expression vector pGFPPspo0A was transformed to B579 by Electrotransformation. ［Result］ Both restriction analysis and PCR proved that recombinant plasmid pGFPPspo0A was constructed correctly. Sequencing result proved that the homology of nucleotide sequence of target gene was 98% to that reported in GenBank. ［Conclusion］ The study will lay a foundation for further study form law of biocontrol bacterium B579.
Key words Biocontrol bacterium; Bacillus subtilis; Spore
作者简介 贾钧辉（1986- ），男，天津人，硕士研究生，研究方向：微生物制药。
收稿日期 20140528
枯草芽孢杆菌是一种好氧、产芽孢、杆状的革兰氏阳性细菌，对人畜无毒无害，能产生多种抗菌素和酶，具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力。许多性状优良的枯草芽孢杆菌生防菌株已经进行温室或大田防治研究，对黄瓜［1］、辣椒［2］、水稻［3］、小麦［4］等农作物病害显出较好的防治效果。枯草芽孢杆菌在发酵过程中有生成芽孢的特性，芽孢的大量生成会严重影响一些目的产物的生产和高浓度菌体的获得。因此，在发酵中前期应严格控制发酵条件，及时检测菌体生长状态，预防过早生成芽孢，而在发酵后期应促进芽孢的生成，从而有利于高芽孢浓度菌剂的制备［5］。对于芽孢的形成就目前的研究进展来看，主要是AbrB蛋白和spo0家族基因。spo0家族基因包括很多，如，spo0A，spo0B，spo0F等。spo0A是进入芽孢阶段重要的转录调控因子，是DNA复制的抑制剂［6］。孢子形成的起始被一个复杂集合体-蛋白激酶，磷酸化蛋白和磷酸酯酶所控制的。多组分物质的磷酸化允许输入和多重集合，不连续的新陈代谢和环境因子。这个信号转导系统输出的决定性是Spo0A转录因子的磷酸化。
课题组前期研究中筛选到的枯草芽孢杆菌B579，对多种常见的土传病害表现出明显防治效果［7］，具有良好的应用前景。笔者利用基因工程技术对B579芽孢形成的关键基因进行分析，获得了含有绿色荧光蛋白基因和芽孢形成关键基因Spo0A的重组质粒，以期为进一步研究生防菌B579芽孢形成规律奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌种及载体。供试菌种为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）B579，质粒为pUC18和pGFP。
1.1.2 主要试剂。限制性内切酶Xba I和EcoR I、pfu聚合酶、T4DNA连接酶、DNA提取试剂盒、质粒小提试剂盒和DNA marker，均由北京全式金生物技术有限公司提供；胶回收试剂盒，由北京天恩泽基因科技有限公司提供。
1.2 方法
1.2.1 引物设计及合成。根据NCBI报道的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168 spo0A基因序列（Gene ID：938655），分析其启动子Pspo0A，开始设计1对特异性扩增引物，上游引物5’端加有Xba I酶切位点，下游引物5’端加有EcoR I酶切位点：Pspo0A1：5’TGCTCTAGAGTTTCTTCCTCCCCAAATGTAGTTAACAGGA3’，下划线为Xba I酶切位点；Pspo0A2：5’CCGGAATTCACTGCCGGAGTTTCCGGCAGTTTTTTTATTTTGA3’，下划线为EcoR I酶切位点。引物交由大连宝生物工程有限公司合成。
1.2.2 目的基因的扩增。按DNA提取试剂盒说明书提取枯草芽孢杆菌的基因组DNA，以总基因组为模版进行PCR扩增。反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，60 ℃复性20 s，72 ℃延伸15 s，共循环30个循环，72 ℃再延伸10 min。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.2.3
重组表达质粒pGFPPspo0A的构建。将纯化后的PCR产物和载体pGFP78分别经Xba I和EcoR I双酶切，胶回收目的基因片段和载体片段，经T4 DNA连接酶16 ℃连接12 h，构建重组表达质粒pGFPPspo0A，利用电转化法进行转化。
2 结果与分析
2.1 枯草芽孢杆菌B579基因组DNA的提取 枯草芽孢杆菌B579（Bacillus Subtilis B579）基因组DNA质量的好坏直接影响获取spo0A基因启动子（Pspo0A）的质量。因此，取3 ml枯草芽孢杆菌B579（进入对数期）菌液进行基因组DNA的提取，根据电泳图1显示，基因组DNA条带单一，提取完整，并无降解，无杂质，无拖尾，获得了质量较好的基因组DNA。
注：M：Trans15K DNA Marker；1：The genomic DNA。
图1 枯草芽孢杆菌B579基因组DNA
2.2 spo0A序列分析 根据NCBI报道，spo0A基因803 bp。将所测序列与GenBank数据库中的序列进行Blast，与GenBank已公布的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis168 spo0A基因两者相似性分别为97%。因此，说明B579中具有spo0A基因（图2）。
注：M：Trans2KTM Plus DNA Marker；1：spo0A基因 PCR 产物。
图2 spo0A基因PCR产物
2.3 spo0A基因在发酵过程中表达量的分析 取发酵过程中6、8、10 h培养的枯草芽孢杆菌，采用RTPCR法检测spo0A基因在发酵不同时间的表达量。图3、5表明，发酵过程中spo0A基因的表达量是不同的，随发酵过程时间增加，所检测到的CT逐渐增大，表征为spo0A基因的表达量。通过对芽孢形成规律的研究，Spo0A磷酸化是芽孢形成最初始的信号。根据发酵过程活菌及芽孢计数，枯草芽孢杆菌在这个时期进入到芽孢形成的初始阶段，在此阶段进行芽孢形成的干预应具有明显效果。
图4表明，spo0A基因引物的特异性很好。在引物溶解曲线中只出现一个单独的尖峰，说明引物特异性好，根据以上结果可知，在发酵过程6~10 h，spo0A基因表达量与芽孢数量呈正相关。
图3 RTPCR检测枯草芽孢杆菌spo0A基因表达量
图4 spo0A基因引物溶解曲线
图5 CT值随时间变化曲线
2.4 spo0A基因启动子的克隆 根据NCBI报道，spo0A基因启动子（Pspo0A）全长294 bp。以枯草芽孢杆菌B579的基因组DNA为模板，通过PCR，扩增spo0A基因启动子。图6表明，PCR扩增产物亮度明显，在300 bp左右出现特异性条带，其大小与spo0A基因启动子（Pspo0A）294 bp大小基本一致，说明PCR扩增结果正确。
注：M：Trans2KTM Plus DNA Marker；1：spo0A基因启动子 PCR 产物。
图6 spo0A基因启动子PCR产物
2.5 克隆载体的构建 利用pfu聚合酶得到的spo0A基因启动子（Pspo0A）片段为平末端片段，纯化后的片段直接与pGFP78平末端克隆载体连接。挑取单菌落培养，按照质粒小提试剂盒步骤从单克隆菌液中提取质粒，进行PCR扩增及对重组质粒进行双酶切验证。鉴定正确的克隆载体，交由上海生工生物工程技术有限公司测序。
图7为重组克隆质粒PCR验证结果，图7的第1泳道是以重组质粒pGFPPspo0A为模板的PCR反应，得到了一条大小在300 bp左右的条带，大小与图7中PCR产物大小结果相符。图8为重组克隆质粒pGFPPspo0A双酶切验证结果，图中
注：M：Trans Mark I DNA Marker；1：pGFPPspo0A PCR。
图7 重组克隆质粒pGFPPspo0A PCR验证
注：M：Trans2KTM II Plus DNA Marker；1：pGFPPspo0A / EcoR I /Xba I。
图8 重组克隆质粒pGFPPspo0A双酶切验证
显示从pGFPPspo0A上切下一条大小为300 bp左右的片段，大小与PCR结果相符，另一条4 800 bp左右大小的条带与空质粒大小一致，说明克隆载体pGFPPspo0A构建成功。
2.6 spo0A 基因启动子序列分析将所测序列与GenBank数据库中的序列进行Blast，与GenBank已公布的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis168 spo0A基因启动子两者相似性为98%。
3 结论与讨论
试验以枯草芽孢杆菌B579基因组DNA为模板，扩增得到芽孢形成基因启动子Pspo0A，其长度与NCBI上报道的spo0A启动子大小相同，均为294 bp。将Pspo0A连接到pGFP78上，构建pGFPPspo0A重组质粒。通过测序验证质粒构建成功。此重组质粒可以为枯草芽孢杆菌快速检测芽孢形成提供基础。以枯草芽孢杆菌B579 RNA为模版，通过反转录，得到cDNA，RTPCR检测芽孢形成关键基因spo0A的表达量，结果表明在发酵过程前期（6~10 h）中，随发酵过程的进行，spo0A的表达量与芽孢数量呈正相关。该结论为进一步研究提供了重要的理论依据。
参考文献
［1］ 张淑梅，王玉霞，李晶，等．基因标记枯草芽孢杆菌BS68A在黄瓜上定殖［J］．生物技术，2006，16（4）：73-74．
［2］ LEE K J，SERALATHAN K K，HAN S S，et al．Biological control of Phytophthora blight in red pepper（Capsicum annuum L.）using Bacillus subtilis［J］．World Journal of Microbiology and Biotechnology，2008，24：1139-1145．
［3］ 穆常青，潘玮，陆庆光，等．枯草芽孢杆菌对稻瘟病的防治效果评价及机制初探 ［J］．中国生物防治，2006，22（2）：158-160．
［4］ KHAN M R，FISCHER S，EGAN D，et al．Biological control of fusarium seedling blight disease of wheat and barley ［J］．Phytopathology，2006，96：386-394．
［5］ ZHANG Y C，JIA J H，ZHENG Y，et al．Optimization of sporulation of biocontrol bacteria B579 by twostep control strategy ［J］．Agricultural Science and Technology，2011，12（2）：249-252．
［6］ VIRGINIA CASTILLALLORENTE，DANIEL MUOZESPN，LAURENTINO VILLAR，et al．Spo0A．the key transcriptional regulator for entrance into sporulation，is an inhibitor of DNA replication ［J］．The EMBO Journal，2006，25：3890-3899．
［7］ CHEN F，WANG M，ZHENG Y，et al.Quantitative changes of plant defense enzymes and phytohormone in biocontrol of cucumber Fusarium wilt by Bacillus subtilis B579 ［J］.World Journal of Microbiology and Biotechnology，2010，26：675-684.