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【摘要】 目的：对比分析15～24个月及2～5岁CA16感染的普通型与危重症手足口病（hand， foot and mouth disease，HFMD）患者外周血中CD8+T细胞的表达情况，寻找发现与CA16致病有关的免疫病理因素。方法：收集2014年5-8月间昆明市儿童医院感染科确诊的儿童HFMD病例外周血标本共72例，其中普通型32例，危重症40例，采用流式细胞术对患者外周血CD8+T淋巴细胞亚群进行检测分析。结果：15～24个月普通型HFMD患者外周血CD8+T淋巴细胞百分比略高于正常健康儿童参考值，而危重症患者CD8+T细胞略低于正常参考值。此外，与正常参考值相比，2～5岁普通型及危重症患者外周血中CD8+T淋巴细胞百分比均减低，其中危重症患者略低于普通型患者。结论：CA16感染后，不同年龄、不同病情的HFMD患者外周血中CD8+T细胞的表达变化不太明显，说明CA16感染后，患者体内的CD8+T细胞基本能够发挥正常的抗病毒免疫效应。而在危重症时，两个年龄段患者CD8+T细胞百分比略低或减低，说明CA16的持续性感染可能对机体CD8+T细胞的表达产生了影响，使其杀伤病毒效应减低，这可能是CA16感染诱导神经系统并发症发生的免疫病理因素之一。
【关键词】 CA16； CD8+T细胞； 手足口病； 作用
病毒感染后机体内部的天然免疫系统虽然能够快速激活并诱导、招募适应性免疫应答的抗病毒免疫效应，但机体内感染病毒的复制传播能力仍在增加[1-3]。作为特异性杀伤病毒感染细胞的CD8+T细胞，能在病毒感染后快速激活并清除病毒，极大地抑制体内病毒的复制，但体内残存的病毒依然能够逃避机体的免疫自稳，造成体内中枢神经系统的慢性感染。这是由于CD8+T细胞在急性感染期快速清除病毒后，机体内病毒载量已经降低到机体无法识别的水平，此时中枢神经系统中的CD8+T细胞受刺激减少、数量减低，仅有少量存在于中枢神经系统中，而此时中枢神经系统中还可能残存少量未清除的病毒RNA。当机体内环境紊乱，患者疾病恶化时，中枢神经系统中存在的病毒很可能会再次发生复制，感染神经系统，导致中枢神经系统中少量CD8+T细胞无法全部快速识别并杀伤病毒感染细胞，最终促使患者出现严重的神经系统并发症，如无菌性脑膜炎、脑干脑炎等，甚至威胁生命[4-6]。
柯萨奇病毒是微小核糖核酸病毒家族中的成员之一，是感染人类的重要肠道病原体。虽然大多数感染呈现亚临床或轻度症状，但一些急性新生儿感染也常会导致患者病情恶化甚至死亡[7]。近年来暴发的儿童手足口病（Hand，foot and mouth disease，HFMD），柯萨奇病毒A16（Coxsackievirus 16，CA16）就是主要致病病原体之一，5岁以下儿童均极易感染。作为柯萨奇病毒成员之一，CA16感染人体后，患者表现的临床症状大多数较轻，能够自行消退，但少数重症病例也会发生病情恶化并致死的情况[8-13]。目前对于CA16急性感染期，中枢神经系统中的CD8+T细胞能否抑制残留病毒RNA的再次活化或是导致免疫病理反应的发生，或者还是同时参与保护机体及导致疾病还不明确。有研究显示患者感染CA16，体内的抗病毒抗体阳性率增高，提示体液免疫参与了抗CA16的过程，对于细胞免疫在抗CA16中的作用研究还相对较少[14-15]。由于CA16引发的重症病例多表现出严重的神经系统并发症，而CD8+T细胞又是中枢神经系统中起主要杀伤病毒感染细胞的免疫细胞，因此，本研究主要通过比对分析不同年龄段CA16感染的普通型、危重型HFMD患者外周血中CD8+T细胞的表达差异，寻找发现与疾病负担加重有关的免疫因素，进而为临床准确判断并分析疾病提供可参考的理论依据[16]。
1 资料与方法
1.1 一般资料 根据卫生部《手足口病诊疗指南》（2010年版）及《肠道病毒71型（EV71）感染重症病例临床救治专家共识》（2011年版）的诊断标准，选取2014年5-8月昆明市儿童医院感染科确诊的CA16感染的手足口病病例外周血标本共72例，其中普通病例共36例，15～24个月及2～5岁年龄段患者为16例及20例；危重症病例共36例，15～24个月及2～5岁年龄段患者为16例及20例[17-18]。
1.2 试剂及主要仪器 试剂：采用BD公司生产的检测淋巴细胞亚群的试剂盒BD Multitest 6-color TBNK Reagent。该试剂盒中包括识别富集不同淋巴亚群（T细胞、B细胞以及NK细胞）的抗体，其中包括识别NK细胞的抗体（CD16和CD56 PE）、识别T细胞的抗体（CD3 FITC）、为淋巴细胞群设置的CD45 PerCP-Cy?5.5、检测CD4+T细胞的CD4 PE-Cy?7、识别B淋巴细胞的CD19 APC以及识别CD8+T细胞的CD8 APC-Cy7。主要检测仪器：BD FACSCanto?，使用BD FACSCanto?软件进行参数设置、质控监测以及数据分析。
1.3 方法 流式细胞仪检测：采集静脉血2～3 mL，注于EDTA-Na抗凝管中。按照操作说明书，分别向已编好号的试管中加入20 ?L六色单克隆抗体和同型对照，分别向试管中加入混匀的100 ?L抗凝血；混匀，避光，室温孵育15～20 min；加入已稀释好的溶血素600 ?L混匀避光室温溶血8～10 min，上机检测。
1.4 统计学处理 采用PEMS 3.1软件对所得数据进行统计学分析，由于本研究中同一年龄段普通型、危重症的病例数各不相同，因此采用中位数以及5%～95%置信区间进行统计学分析。
2 结果
2.1 15～24个月普通型与危重症HFMD患者CD8+T细胞的表达情况比较 根据中位数及95%置信区间结果显示（图1），普通型HFMD患者外周血CD8+T淋巴细胞亚群在外周血中所占百分比为20.365%，5%～95%置信区间为24.265%～37.4375%，略高于正常健康儿童参考值（20%，11%～32%），而危重症患者CD8+T淋巴细胞亚群在外周血中所占百分比为19.29%，5%～95%置信区间为11.2985%～38.901%略低于正常参考值。说明此年龄段患者感染CA16初期症状较轻，其体内CD8+T细胞受病毒刺激后能够扩增，但不明显；当患者病情危重时，CD8+T细胞数量略微减低，说明病毒感染后期，其体内CD8+T细胞的免疫活性很可能受到病毒复制的影响，但影响不大。总的来说，该年龄段的普通及危重症患者感染CA16后，其体内的CD8+T细胞均具有免疫活性，但活性不高，推测在抗CA16感染过程中，CD8+T细胞虽能发挥正常的抗病毒免疫反应，但抗病毒作用不强，这很可能是病毒能够反复感染、无法从人体内完全清除的原因。 2.2 2～5岁普通型与危重症HFMD患者CD8+T细胞的表达情况比较 根据中位数及95%置信区间结果显示（图2），普通型患者外周血中CD8+T淋巴细胞百分比为21.11%，5%～95%置信区间为20.09%～38.985%；危重症患者外周血中CD8+T淋巴细胞百分比为20.86%，5%～95%置信区间为14.3185%～40.2085%，与正常健康儿童参考值（24%，14%～33%）相比，普通及危重症患者外周血中CD8+T淋巴细胞百分比均减低，其中危重症患者略低于普通型患者，说明该年龄段不同患者体内的CD8+T细胞的免疫活性均减低，尤其在危重症时更低。另外，与上述15～24个月普通型患者CD8+T细胞略高于正常参考值相反的是，该结果中2～5岁普通型患者体内CD8+T细胞却低于正常参考值。一般来说，儿童淋巴细胞亚群数量的变化与年龄密切相关。正常情况下，2～5岁正常儿童CD8+T细胞的参考值高于15～24个月儿童的参考值，即随年龄增高，CD8+T细胞的表达是升高的。但该结果显示2～5岁普通型HFMD患儿的CD8+T细胞减低，仅略高于15～24个月儿童的正常参考值，这说明年龄较大的HFMD儿童的CD8+T细胞略高于年龄较小的儿童，虽然升高幅度不高，但也可以说明CA16感染的普通型HFMD患者的CD8+T细胞表达基本正常，其免疫学活性受到较小的影响。除此之外，与上述15～24个月危重症患者相似的是2～5岁危重症患者体内的CD8+T细胞减低，且减低较明显，提示这一年龄段患者病情危重时，其体内的CD8+T细胞介导的细胞毒性反应很可能受到病毒复制机制的干扰或抑制，这也很可能是这一年龄段患者急性感染期发生严重神经系统并发症的原因，即体内清除病毒的主要免疫细胞CD8+T细胞的数量及活性减低。
3 讨论
大多数研究表明，CD8+T细胞在应对不同病毒感染时其免疫效应是多样化的。急性感染时，对病毒具有特异性杀伤作用的CD8+T细胞会被迅速激活并大量扩增，同时，体内其他免疫调节因素也会同时发挥抗病毒免疫效应。当T细胞免疫反应达到顶峰时，90%的急性效应CD8+T细胞会死亡，其余的CD8+T细胞会分化为记忆性T细胞，存在于人体内。此时，人体内的病毒感染细胞大量被杀死，但病毒RNA还残留于人体内，对机体造成持续性的慢性感染[19-22]。
本研究对比了不同年龄段普通型和危重症患者外周血CD8+T细胞的表达差异，结果发现不论年龄大小，危重症患者的CD8+T细胞都低于普通型患者，这很可能与病毒感染的急性和持续性有关。CD8+T细胞一般会在急性感染期迅速扩增，清除体内不断复制的病毒，而当病毒持续感染时，体内抗病毒的关键免疫细胞很可能会是其他免疫细胞，如B细胞或CD4+T细胞。对于危重症患者来说，病毒的持续性感染是疾病负担加重的主要原因，此时，CD8+T细胞减低很可能与感染的病毒类型以及机体免疫系统调节机制有关。
此外，本研究不仅反映了HFMD患者体内CD8+T细胞的表达水平，也可反映出CA16对机体内CD8+T细胞的免疫刺激活性较低，在15～24个月普通型患者中，CD8+T细胞略高，而在2～5岁普通型患者中略低。一般来说，患者在感染初期症状较轻，但属于急性感染，此时CD8+T细胞应该处于迅速扩增清除病毒的状态，但本结果中未观察到CD8+T细胞的大量扩增。这一方面说明，CA16感染初期，由于其致病性低及对患者造成的疾病负担较轻，因此机体特异性的CD8+T细胞的扩增不明显。另一方面，CD8+T细胞在2～5岁普通型患者中减低，很可能是该年龄段患者容易感染并发生严重神经系统并发症的原因，具体致病机制可能与感染后期中枢神经系统中CD8+T细胞数量减少以及病毒在中枢神经系统中潜在复制、持续性感染有关。
参考文献
[1] Makhluf H，Shresta S.Innate antiviral immunity against dengue virus[J].Crit Rev Immunol，2015，35（3）：253-260.
[2] Kaplan D E.Immunopathogenesis of hepatitis c virus infection[J].Gastroenterol Clin North Am，2015，44（4）：735-760.
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[10] Bian L，Wang Y，Yao X，et al.Coxsackievirus A6： a new emerging pathogen causing hand， foot and mouth disease outbreaks worldwide[J].Expert Rev Anti Infect Ther，2015，13（9）：1061-1071.
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[16] Melzer N，Hicking G，Bittner S，et al.Excitotoxic neuronal cell death during an oligodendrocyte-directed CD8+T cell attack in the CNS gray matter[J].J Neuroinflammation，2013，10（2）：121.
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（收稿日期：2015-12-30） （本文编辑：周亚杰）
【关键词】 CA16； CD8+T细胞； 手足口病； 作用
病毒感染后机体内部的天然免疫系统虽然能够快速激活并诱导、招募适应性免疫应答的抗病毒免疫效应，但机体内感染病毒的复制传播能力仍在增加[1-3]。作为特异性杀伤病毒感染细胞的CD8+T细胞，能在病毒感染后快速激活并清除病毒，极大地抑制体内病毒的复制，但体内残存的病毒依然能够逃避机体的免疫自稳，造成体内中枢神经系统的慢性感染。这是由于CD8+T细胞在急性感染期快速清除病毒后，机体内病毒载量已经降低到机体无法识别的水平，此时中枢神经系统中的CD8+T细胞受刺激减少、数量减低，仅有少量存在于中枢神经系统中，而此时中枢神经系统中还可能残存少量未清除的病毒RNA。当机体内环境紊乱，患者疾病恶化时，中枢神经系统中存在的病毒很可能会再次发生复制，感染神经系统，导致中枢神经系统中少量CD8+T细胞无法全部快速识别并杀伤病毒感染细胞，最终促使患者出现严重的神经系统并发症，如无菌性脑膜炎、脑干脑炎等，甚至威胁生命[4-6]。
柯萨奇病毒是微小核糖核酸病毒家族中的成员之一，是感染人类的重要肠道病原体。虽然大多数感染呈现亚临床或轻度症状，但一些急性新生儿感染也常会导致患者病情恶化甚至死亡[7]。近年来暴发的儿童手足口病（Hand，foot and mouth disease，HFMD），柯萨奇病毒A16（Coxsackievirus 16，CA16）就是主要致病病原体之一，5岁以下儿童均极易感染。作为柯萨奇病毒成员之一，CA16感染人体后，患者表现的临床症状大多数较轻，能够自行消退，但少数重症病例也会发生病情恶化并致死的情况[8-13]。目前对于CA16急性感染期，中枢神经系统中的CD8+T细胞能否抑制残留病毒RNA的再次活化或是导致免疫病理反应的发生，或者还是同时参与保护机体及导致疾病还不明确。有研究显示患者感染CA16，体内的抗病毒抗体阳性率增高，提示体液免疫参与了抗CA16的过程，对于细胞免疫在抗CA16中的作用研究还相对较少[14-15]。由于CA16引发的重症病例多表现出严重的神经系统并发症，而CD8+T细胞又是中枢神经系统中起主要杀伤病毒感染细胞的免疫细胞，因此，本研究主要通过比对分析不同年龄段CA16感染的普通型、危重型HFMD患者外周血中CD8+T细胞的表达差异，寻找发现与疾病负担加重有关的免疫因素，进而为临床准确判断并分析疾病提供可参考的理论依据[16]。
1 资料与方法
1.1 一般资料 根据卫生部《手足口病诊疗指南》（2010年版）及《肠道病毒71型（EV71）感染重症病例临床救治专家共识》（2011年版）的诊断标准，选取2014年5-8月昆明市儿童医院感染科确诊的CA16感染的手足口病病例外周血标本共72例，其中普通病例共36例，15～24个月及2～5岁年龄段患者为16例及20例；危重症病例共36例，15～24个月及2～5岁年龄段患者为16例及20例[17-18]。
1.2 试剂及主要仪器 试剂：采用BD公司生产的检测淋巴细胞亚群的试剂盒BD Multitest 6-color TBNK Reagent。该试剂盒中包括识别富集不同淋巴亚群（T细胞、B细胞以及NK细胞）的抗体，其中包括识别NK细胞的抗体（CD16和CD56 PE）、识别T细胞的抗体（CD3 FITC）、为淋巴细胞群设置的CD45 PerCP-Cy?5.5、检测CD4+T细胞的CD4 PE-Cy?7、识别B淋巴细胞的CD19 APC以及识别CD8+T细胞的CD8 APC-Cy7。主要检测仪器：BD FACSCanto?，使用BD FACSCanto?软件进行参数设置、质控监测以及数据分析。
1.3 方法 流式细胞仪检测：采集静脉血2～3 mL，注于EDTA-Na抗凝管中。按照操作说明书，分别向已编好号的试管中加入20 ?L六色单克隆抗体和同型对照，分别向试管中加入混匀的100 ?L抗凝血；混匀，避光，室温孵育15～20 min；加入已稀释好的溶血素600 ?L混匀避光室温溶血8～10 min，上机检测。
1.4 统计学处理 采用PEMS 3.1软件对所得数据进行统计学分析，由于本研究中同一年龄段普通型、危重症的病例数各不相同，因此采用中位数以及5%～95%置信区间进行统计学分析。
2 结果
2.1 15～24个月普通型与危重症HFMD患者CD8+T细胞的表达情况比较 根据中位数及95%置信区间结果显示（图1），普通型HFMD患者外周血CD8+T淋巴细胞亚群在外周血中所占百分比为20.365%，5%～95%置信区间为24.265%～37.4375%，略高于正常健康儿童参考值（20%，11%～32%），而危重症患者CD8+T淋巴细胞亚群在外周血中所占百分比为19.29%，5%～95%置信区间为11.2985%～38.901%略低于正常参考值。说明此年龄段患者感染CA16初期症状较轻，其体内CD8+T细胞受病毒刺激后能够扩增，但不明显；当患者病情危重时，CD8+T细胞数量略微减低，说明病毒感染后期，其体内CD8+T细胞的免疫活性很可能受到病毒复制的影响，但影响不大。总的来说，该年龄段的普通及危重症患者感染CA16后，其体内的CD8+T细胞均具有免疫活性，但活性不高，推测在抗CA16感染过程中，CD8+T细胞虽能发挥正常的抗病毒免疫反应，但抗病毒作用不强，这很可能是病毒能够反复感染、无法从人体内完全清除的原因。 2.2 2～5岁普通型与危重症HFMD患者CD8+T细胞的表达情况比较 根据中位数及95%置信区间结果显示（图2），普通型患者外周血中CD8+T淋巴细胞百分比为21.11%，5%～95%置信区间为20.09%～38.985%；危重症患者外周血中CD8+T淋巴细胞百分比为20.86%，5%～95%置信区间为14.3185%～40.2085%，与正常健康儿童参考值（24%，14%～33%）相比，普通及危重症患者外周血中CD8+T淋巴细胞百分比均减低，其中危重症患者略低于普通型患者，说明该年龄段不同患者体内的CD8+T细胞的免疫活性均减低，尤其在危重症时更低。另外，与上述15～24个月普通型患者CD8+T细胞略高于正常参考值相反的是，该结果中2～5岁普通型患者体内CD8+T细胞却低于正常参考值。一般来说，儿童淋巴细胞亚群数量的变化与年龄密切相关。正常情况下，2～5岁正常儿童CD8+T细胞的参考值高于15～24个月儿童的参考值，即随年龄增高，CD8+T细胞的表达是升高的。但该结果显示2～5岁普通型HFMD患儿的CD8+T细胞减低，仅略高于15～24个月儿童的正常参考值，这说明年龄较大的HFMD儿童的CD8+T细胞略高于年龄较小的儿童，虽然升高幅度不高，但也可以说明CA16感染的普通型HFMD患者的CD8+T细胞表达基本正常，其免疫学活性受到较小的影响。除此之外，与上述15～24个月危重症患者相似的是2～5岁危重症患者体内的CD8+T细胞减低，且减低较明显，提示这一年龄段患者病情危重时，其体内的CD8+T细胞介导的细胞毒性反应很可能受到病毒复制机制的干扰或抑制，这也很可能是这一年龄段患者急性感染期发生严重神经系统并发症的原因，即体内清除病毒的主要免疫细胞CD8+T细胞的数量及活性减低。
3 讨论
大多数研究表明，CD8+T细胞在应对不同病毒感染时其免疫效应是多样化的。急性感染时，对病毒具有特异性杀伤作用的CD8+T细胞会被迅速激活并大量扩增，同时，体内其他免疫调节因素也会同时发挥抗病毒免疫效应。当T细胞免疫反应达到顶峰时，90%的急性效应CD8+T细胞会死亡，其余的CD8+T细胞会分化为记忆性T细胞，存在于人体内。此时，人体内的病毒感染细胞大量被杀死，但病毒RNA还残留于人体内，对机体造成持续性的慢性感染[19-22]。
本研究对比了不同年龄段普通型和危重症患者外周血CD8+T细胞的表达差异，结果发现不论年龄大小，危重症患者的CD8+T细胞都低于普通型患者，这很可能与病毒感染的急性和持续性有关。CD8+T细胞一般会在急性感染期迅速扩增，清除体内不断复制的病毒，而当病毒持续感染时，体内抗病毒的关键免疫细胞很可能会是其他免疫细胞，如B细胞或CD4+T细胞。对于危重症患者来说，病毒的持续性感染是疾病负担加重的主要原因，此时，CD8+T细胞减低很可能与感染的病毒类型以及机体免疫系统调节机制有关。
此外，本研究不仅反映了HFMD患者体内CD8+T细胞的表达水平，也可反映出CA16对机体内CD8+T细胞的免疫刺激活性较低，在15～24个月普通型患者中，CD8+T细胞略高，而在2～5岁普通型患者中略低。一般来说，患者在感染初期症状较轻，但属于急性感染，此时CD8+T细胞应该处于迅速扩增清除病毒的状态，但本结果中未观察到CD8+T细胞的大量扩增。这一方面说明，CA16感染初期，由于其致病性低及对患者造成的疾病负担较轻，因此机体特异性的CD8+T细胞的扩增不明显。另一方面，CD8+T细胞在2～5岁普通型患者中减低，很可能是该年龄段患者容易感染并发生严重神经系统并发症的原因，具体致病机制可能与感染后期中枢神经系统中CD8+T细胞数量减少以及病毒在中枢神经系统中潜在复制、持续性感染有关。
参考文献
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[9] Wong L C，Behr E R.Sudden unexplained death in infants and children：the role of undiagnosed inherited cardiac conditions[J].Europace，2014，16（12）：1706-1713.
[10] Bian L，Wang Y，Yao X，et al.Coxsackievirus A6： a new emerging pathogen causing hand， foot and mouth disease outbreaks worldwide[J].Expert Rev Anti Infect Ther，2015，13（9）：1061-1071.
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（收稿日期：2015-12-30） （本文编辑：周亚杰）