【摘 要】
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克隆秦川牛的SREBP1基因并构建重组腺病毒表达载体,包装扩繁获得高滴度病毒,拟为在细胞水平上开展基因功能的研究奠定基础。本试验以秦川牛脂肪组织为试验材料,提取总RNA并反
【机 构】
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西北农林科技大学动物科技学院; 国家肉牛改良中心;
【基金项目】
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国家转基因生物新品种培育重大专项(2011ZX08007-002);国家肉牛牦牛产业技术体系(CARS-38);国家自然科学基金(31272411);“十二五”国家863计划(2011AA100307-02);教育部“长江学者和创新团队发展计划”(IRT0940);“十二五”国家科技支撑计划(2011BAD28B04-03)
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克隆秦川牛的SREBP1基因并构建重组腺病毒表达载体,包装扩繁获得高滴度病毒,拟为在细胞水平上开展基因功能的研究奠定基础。本试验以秦川牛脂肪组织为试验材料,提取总RNA并反转得到cDNA,以Gen-Bank收录的牛的SREBP1基因mRNA序列设计引物,PCR扩增SREBP1基因与克隆载体pMD19-T Simple连接并测序鉴定。挑选测序正确的SREBP1基因酶切后连接到腺病毒穿梭载体上构建pAdTrack-CMV-SREBP1表达载体,用PmeⅠ限制酶酶切线性化,然后转染到含有骨架载体pAdEasy-1的E.coli BJ5183感受态进行同源重组,得到腺病毒重组载体pAd-SREBP1。用PacⅠ限制酶酶切线性化pAd-SREBP1载体并回收质粒大片段,转染293A细胞包装病毒并扩繁提高病毒滴度,绿色荧光蛋白(GFP)标记法测定腺病毒的滴度。本试验成功克隆了秦川牛的SREBP1基因,测序结果与GenBank收录的牛的基因序列比较有2处位点突变,均已排除扩增酶的保真性不高等外界因素造成的。将SREBP1基因与穿梭载体连接构建了pAdTrack-CMV-SREBP1表达载体,并与骨架载体重组得到重组腺病毒载体pAd-SREBP1,用PacⅠ酶切线性化包装病毒,扩繁得到病毒滴度为1.5×109 GFU·mL-1高滴度病毒。本研究成功克隆秦川牛SREBP1基因并重组成病毒重组子,包装扩繁得到高滴度腺病毒。
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