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建立了超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)同时测定何首乌中二苯乙烯(二苯乙烯苷、虎杖苷、白藜芦醇)、蒽醌(大黄素、大黄素甲醚、大黄素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸)、黄酮(表儿茶素、芦丁、金丝桃苷、紫云英苷、槲皮素)和酚酸(没食子酸)等4类共14种目标成分的方法。何首乌样品用70%甲醇在室温下以料液比1∶25超声提取45min,提取液以12 000r/min离心10min,取上清液,经0.22μm微孔滤膜过滤。采用Waters BEH C18色谱柱(100mm×2.1mm×1.7μm),以水(含0.1%甲酸)-乙腈为流动相,梯度洗脱,柱温35℃,体积流量0.25mL/min,电喷雾离子源(ESI),多反应离子监测(MRM)扫描方式进行检测。结果表明:14种目标化合物在一定浓度范围内均呈现良好的线性关系,线性相关系数大于0.991 5;精密度、重复性和稳定性良好;加样回收率在95.85%~102.13%之间,RSD均小于5%。该方法操作简便、灵敏度高、重现性好,可用于何首乌中多元功效物质或指标成分的同时测定,为何首乌药材内在质量的综合评价和全面控制提供新的方法参考。